მოდიკის ცვლილებების ცხოველური მოდელის შესაქმნელად წელის სუბქონდრულ ძვალში ჩანერგილი აუტოლოგიური პულპოზური ბირთვი

გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო შედეგის მისაღებად, გირჩევთ გამოიყენოთ უფრო ახალი ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
მოდიკური ცვლილების (MC) ცხოველური მოდელების დადგენა MC-ს შესწავლის მნიშვნელოვან საფუძველს წარმოადგენს. 54 ახალი ზელანდიის თეთრი კურდღელი დაიყო ცრუოპერაციის ჯგუფად, კუნთების იმპლანტაციის ჯგუფად (ME ჯგუფი) და ბირთვის პულპოზუსის იმპლანტაციის ჯგუფად (NPE ჯგუფი). NPE ჯგუფში მალთაშუა დისკი გამოიკვეთა ანტეროლატერალური წელის ქირურგიული მიდგომით და ნემსით იქნა გახვრეტილი L5 მალის სხეული ბოლო ფირფიტასთან ახლოს. NP ამოღებული იქნა L1/2 მალთაშუა დისკიდან შპრიცით და შეყვანილი იქნა მასში. ხვრეტის გაბურღვა სუბქონდრულ ძვალში. ქირურგიული პროცედურები და ბურღვის მეთოდები კუნთების იმპლანტაციის ჯგუფსა და ცრუოპერაციის ჯგუფში იგივე იყო, რაც NP იმპლანტაციის ჯგუფში. ME ჯგუფში კუნთის ნაწილი მოათავსეს ხვრელში, ხოლო ცრუოპერაციის ჯგუფში არაფერი მოათავსეს ხვრელში. ოპერაციის შემდეგ ჩატარდა მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია და მოლეკულური ბიოლოგიური ტესტირება. NPE ჯგუფში სიგნალი შეიცვალა, მაგრამ ცრუოპერაციის ჯგუფსა და ME ჯგუფში სიგნალის აშკარა ცვლილება არ დაფიქსირებულა. ჰისტოლოგიურმა დაკვირვებამ აჩვენა, რომ იმპლანტაციის ადგილას დაფიქსირდა ქსოვილების პათოლოგიური პროლიფერაცია და NPE ჯგუფში გაიზარდა IL-4, IL-17 და IFN-γ ექსპრესია. NP-ს იმპლანტაციამ სუბქონდრულ ძვალში შეიძლება წარმოქმნას MC-ს ცხოველური მოდელი.
მოდიკური ცვლილებები (MC) არის ხერხემლის ბოლო ფირფიტებისა და მიმდებარე ძვლის ტვინის დაზიანებები, რომლებიც ჩანს მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიით (MRI). ისინი საკმაოდ ხშირია თანმხლები სიმპტომების მქონე პირებში1. მრავალმა კვლევამ ხაზი გაუსვა MC-ს მნიშვნელობას წელის ტკივილთან (LBP) კავშირის გამო2,3. დე რუსმა და სხვებმა4 და მოდიკმა და სხვებმა5 დამოუკიდებლად პირველად აღწერეს ხერხემლის ძვლის ტვინში სუბქონდრული სიგნალის ანომალიების სამი განსხვავებული ტიპი. მოდიკური I ტიპის ცვლილებები ჰიპოინტენსიურია T1-შეწონილ (T1W) თანმიმდევრობებზე და ჰიპერინტენსიურია T2-შეწონილ (T2W) თანმიმდევრობებზე. ეს დაზიანება ავლენს ნაპრალისებრ ბოლო ფირფიტებს და მიმდებარე სისხლძარღვოვან გრანულაციურ ქსოვილს ძვლის ტვინში. მოდიკური II ტიპის ცვლილებები აჩვენებს მაღალ სიგნალს როგორც T1W, ასევე T2W თანმიმდევრობებზე. ამ ტიპის დაზიანების დროს შეიძლება გამოვლინდეს ბოლო ფირფიტების დესტრუქცია, ასევე მიმდებარე ძვლის ტვინის ჰისტოლოგიური ცხიმოვანი ჩანაცვლება. მოდიკური III ტიპის ცვლილებები აჩვენებს დაბალ სიგნალს T1W და T2W თანმიმდევრობებში. დაფიქსირდა ბოლო ფირფიტებთან შესაბამისი სკლეროზული დაზიანებები6. MC ხერხემლის პათოლოგიურ დაავადებად ითვლება და მჭიდრო კავშირშია ხერხემლის მრავალ დეგენერაციულ დაავადებასთან7,8,9.
არსებული მონაცემების გათვალისწინებით, რამდენიმე კვლევამ დეტალური ინფორმაცია მოგვაწოდა მიკროდისფუნქციის ეტიოლოგიისა და პათოლოგიური მექანიზმების შესახებ. ალბერტმა და სხვებმა ივარაუდეს, რომ მიკროდისკულური მალფორმაცია შესაძლოა გამოწვეული იყოს დისკის თიაქარით8. ჰუმ და სხვებმა მიკროდისკულური მალფორმაცია დისკის მძიმე დეგენერაციას მიაწერეს10. კროკმა შემოგვთავაზა „შიდა დისკის გახეთქვის“ კონცეფცია, რომელიც გულისხმობს, რომ დისკის განმეორებითმა ტრავმამ შეიძლება გამოიწვიოს ბოლო ფირფიტის მიკროგახეთქვა. ნაპრალის წარმოქმნის შემდეგ, ბოლო ფირფიტის განადგურებამ პულპოსუს ბირთვის (NP) მიერ შეიძლება გამოიწვიოს აუტოიმუნური პასუხი, რაც შემდგომში იწვევს MC11-ის განვითარებას. მა და სხვებმა გაიზიარეს მსგავსი შეხედულება და განაცხადეს, რომ NP-ით გამოწვეული აუტოიმუნური დაავადება მნიშვნელოვან როლს ასრულებს MC12-ის პათოგენეზში.
იმუნური სისტემის უჯრედები, განსაკუთრებით CD4+ T ჰელპერ ლიმფოციტები, გადამწყვეტ როლს ასრულებენ აუტოიმუნური დაავადების პათოგენეზში13. ახლახან აღმოჩენილი Th17 ქვეჯგუფი წარმოქმნის პროანთებით ციტოკინ IL-17-ს, ხელს უწყობს ქემოკინების ექსპრესიას და ასტიმულირებს დაზიანებულ ორგანოებში T უჯრედებს IFN-γ14-ის გამოსამუშავებლად. Th2 უჯრედები ასევე უნიკალურ როლს ასრულებენ იმუნური პასუხების პათოგენეზში. IL-4-ის, როგორც წარმომადგენლობითი Th2 უჯრედის, ექსპრესიამ შეიძლება გამოიწვიოს მძიმე იმუნოპათოლოგიური შედეგები15.
მიუხედავად იმისა, რომ MC16,17,18,19,20,21,22,23,24-ზე მრავალი კლინიკური კვლევა ჩატარდა, ჯერ კიდევ არ არსებობს შესაბამისი ცხოველებზე ჩატარებული ექსპერიმენტული მოდელები, რომლებსაც შეუძლიათ ადამიანებში ხშირად მიმდინარე MC პროცესის იმიტაცია და რომელთა გამოყენება შესაძლებელია ეტიოლოგიის ან ახალი მკურნალობის მეთოდების, მაგალითად, მიზნობრივი თერაპიის, შესასწავლად. დღემდე, MC-ს მხოლოდ რამდენიმე ცხოველური მოდელია აღწერილი, რომლებიც პათოლოგიური მექანიზმების შესწავლას გულისხმობს.
ალბერტისა და მას მიერ შემოთავაზებულ აუტოიმუნურ თეორიაზე დაყრდნობით, ამ კვლევამ შექმნა მარტივი და რეპროდუცირებადი კურდღლის MC მოდელი ნანონაწილაკების აუტოტრანსპლანტაციით ხერხემლის გაბურღულ ბოლო ფირფიტასთან ახლოს. სხვა მიზნებია ცხოველური მოდელების ჰისტოლოგიური მახასიათებლების დაკვირვება და ნანონაწილაკების სპეციფიკური მექანიზმების შეფასება MC-ს განვითარებაში. ამ მიზნით, MC-ს პროგრესირების შესასწავლად ჩვენ ვიყენებთ ისეთ ტექნიკებს, როგორიცაა მოლეკულური ბიოლოგია, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია და ჰისტოლოგიური კვლევები.
ოპერაციის დროს სისხლდენით ორი კურდღელი გარდაიცვალა, ხოლო მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის დროს ანესთეზიის დროს ოთხი. დარჩენილი 48 კურდღელი გადარჩა და ოპერაციის შემდეგ ქცევითი ან ნევროლოგიური ნიშნები არ გამოვლენილა.
მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია აჩვენებს, რომ სხვადასხვა ხვრელში ჩადგმული ქსოვილის სიგნალის ინტენსივობა განსხვავებულია. NPE ჯგუფში L5 მალის სხეულის სიგნალის ინტენსივობა თანდათან შეიცვალა ჩადგმიდან 12, 16 და 20 კვირის შემდეგ (T1W თანმიმდევრობამ აჩვენა დაბალი სიგნალი, ხოლო T2W თანმიმდევრობამ - შერეული სიგნალი პლუს დაბალი სიგნალი) (სურ. 1C), მაშინ როდესაც ჩადგმული ნაწილების სხვა ორი ჯგუფის მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია იმავე პერიოდში შედარებით სტაბილური დარჩა (სურ. 1A, B).
(ა) კურდღლის წელის ხერხემლის წარმომადგენლობითი თანმიმდევრული მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია 3 დროის წერტილში. ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფის სურათებში სიგნალის დარღვევები არ აღმოჩნდა. (ბ) ME ჯგუფში ხერხემლის სხეულის სიგნალის მახასიათებლები ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფის მსგავსია და დროთა განმავლობაში ჩასმის ადგილას სიგნალის მნიშვნელოვანი ცვლილება არ შეინიშნება. (გ) NPE ჯგუფში დაბალი სიგნალი აშკარად ჩანს T1W თანმიმდევრობაში, ხოლო შერეული სიგნალი და დაბალი სიგნალი აშკარად ჩანს T2W თანმიმდევრობაში. 12-კვირიანი პერიოდიდან 20-კვირიან პერიოდამდე, T2W თანმიმდევრობაში დაბალი სიგნალების გარშემო სპორადული მაღალი სიგნალები მცირდება.
NPE ჯგუფში ხერხემლის სხეულის იმპლანტაციის ადგილას შეინიშნება ძვლის აშკარა ჰიპერპლაზია, ხოლო ძვლის ჰიპერპლაზია უფრო სწრაფად ვითარდება 12-დან 20 კვირამდე (სურ. 2C) NPE ჯგუფთან შედარებით, მოდელირებულ ხერხემლის სხეულებში მნიშვნელოვანი ცვლილება არ შეინიშნება; პლაცებოს ჯგუფში და ME ჯგუფში (სურ. 2C) (2A,B).
(ა) იმპლანტირებულ ნაწილში ხერხემლის სხეულის ზედაპირი ძალიან გლუვია, ნახვრეტი კარგად შეხორცდება და ხერხემლის სხეულში ჰიპერპლაზია არ აღინიშნება. (ბ) ემულგატორიული ენცეფალოპათიის ჯგუფში იმპლანტირებული ადგილის ფორმა მსგავსია ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფში არსებულისა და დროთა განმავლობაში იმპლანტირებული ადგილის გარეგნულ იერსახეში აშკარა ცვლილება არ შეინიშნება. (გ) ენდოსკოპიური ენცეფალოპათიის ჯგუფში იმპლანტირებულ ადგილას ძვლის ჰიპერპლაზია დაფიქსირდა. ძვლის ჰიპერპლაზია სწრაფად გაიზარდა და მალთაშუა დისკის გავლით კონტრალატერალურ ხერხემლის სხეულზეც კი გავრცელდა.
ჰისტოლოგიური ანალიზი უფრო დეტალურ ინფორმაციას გვაწვდის ძვლის ფორმირების შესახებ. სურათი 3 გვიჩვენებს H&E-თი შეღებილი პოსტოპერაციული მონაკვეთების ფოტოებს. ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფში ქონდროციტები კარგად იყო განლაგებული და უჯრედების პროლიფერაცია არ დაფიქსირებულა (სურ. 3A). ME ჯგუფში სიტუაცია მსგავსი იყო ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფში არსებულისა (სურ. 3B). თუმცა, NPE ჯგუფში იმპლანტაციის ადგილას დაფიქსირდა ქონდროციტების დიდი რაოდენობა და NP-ის მსგავსი უჯრედების პროლიფერაცია (სურ. 3C);
(ა) ტრაბეკულები ჩანს ბოლო ფირფიტასთან ახლოს, ქონდროციტები მოწესრიგებულადაა განლაგებული, ერთგვაროვანი უჯრედის ზომითა და ფორმით და პროლიფერაციის გარეშე (40-ჯერ). (ბ) ME ჯგუფში იმპლანტაციის ადგილის მდგომარეობა მსგავსია ფიქტიური ჯგუფის მდგომარეობისა. ტრაბეკულები და ქონდროციტები ჩანს, მაგრამ იმპლანტაციის ადგილას აშკარა პროლიფერაცია არ არის (40-ჯერ). (ბ) ჩანს, რომ ქონდროციტები და NP-ის მსგავსი უჯრედები მნიშვნელოვნად მრავლდებიან და ქონდროციტების ფორმა და ზომა არათანაბარია (40-ჯერ).
ინტერლეიკინ 4-ის (IL-4) mRNA-ს, ინტერლეიკინ 17-ის (IL-17) mRNA-ს და ინტერფერონ γ (IFN-γ) mRNA-ს ექსპრესია დაფიქსირდა როგორც NPE, ასევე ME ჯგუფებში. როდესაც სამიზნე გენების ექსპრესიის დონეები შედარებული იქნა, IL-4, IL-17 და IFN-γ გენების ექსპრესია მნიშვნელოვნად გაიზარდა NPE ჯგუფში ME ჯგუფთან და ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფთან შედარებით (სურ. 4) (P < 0.05). ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფთან შედარებით, IL-4, IL-17 და IFN-γ ექსპრესიის დონეები ME ჯგუფში მხოლოდ უმნიშვნელოდ გაიზარდა და სტატისტიკურ ცვლილებას არ მიაღწია (P > 0.05).
NPE ჯგუფში IL-4, IL-17 და IFN-γ mRNA ექსპრესიამ მნიშვნელოვნად მაღალი ტენდენცია აჩვენა, ვიდრე ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფსა და ME ჯგუფში (P < 0.05).
ამის საპირისპიროდ, ME ჯგუფში ექსპრესიის დონეებმა მნიშვნელოვანი განსხვავება არ აჩვენა (P>0.05).
mRNA ექსპრესიის შეცვლილი ნიმუშის დასადასტურებლად ჩატარდა Western blot ანალიზი IL-4-ისა და IL-17-ის საწინააღმდეგო კომერციულად ხელმისაწვდომი ანტისხეულების გამოყენებით. როგორც ნაჩვენებია ნახაზებში 5A,B, ME ჯგუფთან და ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფთან შედარებით, NPE ჯგუფში IL-4-ისა და IL-17-ის ცილის დონე მნიშვნელოვნად გაიზარდა (P < 0.05). ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფთან შედარებით, ME ჯგუფში IL-4-ისა და IL-17-ის ცილის დონემ ასევე ვერ მიაღწია სტატისტიკურად მნიშვნელოვან ცვლილებებს (P> 0.05).
(A) NPE ჯგუფში IL-4-ის და IL-17-ის ცილის დონეები მნიშვნელოვნად მაღალი იყო, ვიდრე ME ჯგუფსა და პლაცებო ჯგუფში (P < 0.05). (B) Western blot ჰისტოგრამა.
ქირურგიული ოპერაციის დროს მიღებული ადამიანის ნიმუშების შეზღუდული რაოდენობის გამო, MC-ის პათოგენეზის მკაფიო და დეტალური კვლევები გარკვეულწილად რთულია. ჩვენ ვცადეთ MC-ის ცხოველური მოდელის შექმნა მისი პოტენციური პათოლოგიური მექანიზმების შესასწავლად. ამავდროულად, რადიოლოგიური შეფასება, ჰისტოლოგიური შეფასება და მოლეკულურ-ბიოლოგიური შეფასება გამოყენებული იქნა NP აუტოტრანსპლანტატით გამოწვეული MC-ის მიმდინარეობის თვალყურის დევნებისთვის. შედეგად, NP იმპლანტაციის მოდელმა გამოიწვია სიგნალის ინტენსივობის თანდათანობითი ცვლილება 12 კვირიდან 20 კვირამდე დროის წერტილებამდე (შერეული დაბალი სიგნალი T1W თანმიმდევრობებში და დაბალი სიგნალი T2W თანმიმდევრობებში), რაც მიუთითებს ქსოვილის ცვლილებებზე, ხოლო ჰისტოლოგიურმა და მოლეკულურ-ბიოლოგიურმა შეფასებებმა დაადასტურა რადიოლოგიური კვლევის შედეგები.
ამ ექსპერიმენტის შედეგები აჩვენებს, რომ NPE ჯგუფში ხერხემლის სხეულის დარღვევის ადგილას ვიზუალური და ჰისტოლოგიური ცვლილებები მოხდა. ამავდროულად, დაფიქსირდა IL-4, IL-17 და IFN-γ გენების, ასევე IL-4, IL-17 და IFN-γ გენების ექსპრესია, რაც მიუთითებს, რომ ხერხემლის სხეულში აუტოლოგიური ბირთვის პულპოზუსის ქსოვილის დარღვევამ შეიძლება გამოიწვიოს სიგნალური და მორფოლოგიური ცვლილებების სერია. ადვილი შესამჩნევია, რომ ცხოველური მოდელის ხერხემლის სხეულების სიგნალის მახასიათებლები (დაბალი სიგნალი T1W თანმიმდევრობაში, შერეული სიგნალი და დაბალი სიგნალი T2W თანმიმდევრობაში) ძალიან ჰგავს ადამიანის ხერხემლის უჯრედების სიგნალის მახასიათებლებს და მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის მახასიათებლები ასევე ადასტურებს ჰისტოლოგიისა და უხეში ანატომიის დაკვირვებებს, ანუ ხერხემლის სხეულის უჯრედებში ცვლილებები პროგრესირებადია. მიუხედავად იმისა, რომ მწვავე ტრავმით გამოწვეული ანთებითი პასუხი შეიძლება გამოვლინდეს პუნქციიდან მალევე, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის შედეგებმა აჩვენა, რომ პროგრესულად მზარდი სიგნალის ცვლილებები გამოჩნდა პუნქციიდან 12 კვირის შემდეგ და გაგრძელდა 20 კვირამდე, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის ცვლილებების აღდგენის ან შებრუნების ნიშნების გარეშე. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ აუტოლოგიური ხერხემლის NP წარმოადგენს კურდღლებში პროგრესირებადი MV-ის დასადგენად საიმედო მეთოდს.
პუნქციის ეს მოდელი საჭიროებს საკმარის უნარს, დროსა და ქირურგიულ ძალისხმევას. წინასწარი ექსპერიმენტების დროს, პარავერტებრული იოგების სტრუქტურების დისექციამ ან ზედმეტმა სტიმულაციამ შეიძლება გამოიწვიოს ხერხემლის ოსტეოფიტების წარმოქმნა. სიფრთხილეა საჭირო, რომ არ დაზიანდეს ან არ გაღიზიანდეს მიმდებარე დისკები. რადგან შეღწევადობის სიღრმე უნდა იყოს კონტროლირებადი თანმიმდევრული და რეპროდუცირებადი შედეგების მისაღებად, ჩვენ ხელით გავაკეთეთ საცობი 3 მმ სიგრძის ნემსის გარსის მოჭრით. ამ საცობის გამოყენება უზრუნველყოფს ხერხემლის სხეულში ბურღვის ერთგვაროვან სიღრმეს. წინასწარი ექსპერიმენტების დროს, ოპერაციაში მონაწილე სამმა ორთოპედმა ქირურგმა აღმოაჩინა, რომ 16 კალიბრის ნემსებთან მუშაობა უფრო ადვილი იყო, ვიდრე 18 კალიბრის ნემსებთან ან სხვა მეთოდებთან. ბურღვის დროს ჭარბი სისხლდენის თავიდან ასაცილებლად, ნემსის გარკვეული დროით უძრავად დაჭერა უზრუნველყოფს უფრო შესაფერის ჩასადგმელ ხვრელს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ამ გზით შესაძლებელია MC-ს გარკვეული ხარისხის კონტროლი.
მიუხედავად იმისა, რომ მრავალი კვლევა MC-ზე იყო მიმართული, MC25,26,27-ის ეტიოლოგიისა და პათოგენეზის შესახებ ცოტა რამ არის ცნობილი. ჩვენს წინა კვლევებზე დაყრდნობით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ აუტოიმუნური რეაქცია მნიშვნელოვან როლს ასრულებს MC12-ის წარმოქმნასა და განვითარებაში. ამ კვლევაში შესწავლილი იყო IL-4, IL-17 და IFN-γ-ის რაოდენობრივი ექსპრესია, რომლებიც ანტიგენური სტიმულაციის შემდეგ CD4+ უჯრედების დიფერენციაციის ძირითადი გზებია. ჩვენს კვლევაში, ნეგატიურ ჯგუფთან შედარებით, NPE ჯგუფს ჰქონდა IL-4, IL-17 და IFN-γ-ის უფრო მაღალი ექსპრესია, ასევე უფრო მაღალი იყო IL-4 და IL-17 ცილების დონეები.
კლინიკურად, IL-17 mRNA ექსპრესია მომატებულია დისკის თიაქრის მქონე პაციენტების NP უჯრედებში28. IL-4 და IFN-γ ექსპრესიის მომატებული დონეები ასევე აღმოჩნდა მწვავე არაკომპრესიული დისკის თიაქრის მოდელში ჯანმრთელ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით29. IL-17 მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ანთებაში, ქსოვილების დაზიანებაში აუტოიმუნური დაავადებების დროს30 და აძლიერებს იმუნურ პასუხს IFN-γ31-ზე. IL-17-ით განპირობებული ქსოვილების დაზიანების გაძლიერება დაფიქსირდა MRL/lpr თაგვებში32 და აუტოიმუნური დაავადებებისადმი მგრძნობიარე თაგვებში33. IL-4-ს შეუძლია დათრგუნოს პროანთებითი ციტოკინების (როგორიცაა IL-1β და TNFα) ექსპრესია და მაკროფაგების აქტივაცია34. აღინიშნა, რომ IL-4-ის mRNA ექსპრესია განსხვავებული იყო NPE ჯგუფში IL-17-თან და IFN-γ-სთან შედარებით იმავე დროს; IFN-γ-ის mRNA ექსპრესია NPE ჯგუფში მნიშვნელოვნად მაღალი იყო, ვიდრე სხვა ჯგუფებში. ამიტომ, IFN-γ წარმოება შეიძლება იყოს NP ინტერკალაციით გამოწვეული ანთებითი პასუხის მედიატორი. კვლევებმა აჩვენა, რომ IFN-γ წარმოიქმნება უჯრედების მრავალი ტიპის მიერ, მათ შორის გააქტიურებული 1 ტიპის დამხმარე T უჯრედების, ბუნებრივი კილერი უჯრედების და მაკროფაგების35,36 მიერ და წარმოადგენს ძირითად პროანთებით ციტოკინს, რომელიც ხელს უწყობს იმუნურ პასუხებს37.
ეს კვლევა ვარაუდობს, რომ აუტოიმუნური პასუხი შეიძლება ჩართული იყოს MC-ის წარმოქმნასა და განვითარებაში. ლუომამ და სხვებმა აღმოაჩინეს, რომ MC-ის და გამოკვეთილი NP-ის სიგნალის მახასიათებლები მსგავსია MRI-ზე და ორივე აჩვენებს მაღალ სიგნალს T2W თანმიმდევრობაში38. დადასტურებულია, რომ ზოგიერთი ციტოკინი მჭიდრო კავშირშია MC-ის წარმოქმნასთან, როგორიცაა IL-139. მა და სხვებმა ივარაუდეს, რომ NP-ის აღმავალი ან დაღმავალი პროტრუზია შეიძლება დიდ გავლენას ახდენდეს MC12-ის წარმოქმნასა და განვითარებაზე. ბობეჩკომ40 და ჰერცბეინმა და სხვებმა41 აღნიშნეს, რომ NP არის იმუნოტოლერანტული ქსოვილი, რომელსაც დაბადებიდან არ შეუძლია სისხლძარღვთა ცირკულაციაში შესვლა. NP პროტრუზიები შეჰყავს უცხო სხეულები სისხლის მიწოდებაში, რითაც ხელს უწყობს ადგილობრივ აუტოიმუნურ რეაქციებს42. აუტოიმუნურ რეაქციებს შეუძლიათ იმუნური ფაქტორების დიდი რაოდენობის ინდუცირება და როდესაც ეს ფაქტორები მუდმივად ექვემდებარება ქსოვილებს, მათ შეუძლიათ გამოიწვიონ ცვლილებები სიგნალიზაციაში43. ამ კვლევაში, IL-4, IL-17 და IFN-γ-ის ჭარბი ექსპრესია ტიპიური იმუნური ფაქტორებია, რაც კიდევ ერთხელ ადასტურებს NP-სა და MC-ებს შორის მჭიდრო კავშირს44. ეს ცხოველური მოდელი კარგად ბაძავს NP-ის გარღვევას და ბოლო ფირფიტაში შესვლას. ამ პროცესმა კიდევ უფრო გამოავლინა აუტოიმუნური ნივთიერებების გავლენა MC-ზე.
როგორც მოსალოდნელი იყო, ცხოველთა ეს მოდელი გვაძლევს პოტენციურ პლატფორმას MC-ს შესასწავლად. თუმცა, ამ მოდელს მაინც აქვს გარკვეული შეზღუდვები: პირველ რიგში, ცხოველებზე დაკვირვების ფაზაში, ზოგიერთ შუალედურ სტადიის კურდღელს სჭირდება ევთანაზია ჰისტოლოგიური და მოლეკულური ბიოლოგიური ტესტირებისთვის, ამიტომ ზოგიერთი ცხოველი დროთა განმავლობაში „გამოუსადეგარი ხდება“. მეორეც, მიუხედავად იმისა, რომ ამ კვლევაში სამი დროის წერტილია დადგენილი, სამწუხაროდ, ჩვენ მოდელირება გავუკეთეთ MC-ს მხოლოდ ერთი ტიპის (მოდიკის I ტიპის ცვლილება), ამიტომ ეს საკმარისი არ არის ადამიანის დაავადების განვითარების პროცესის წარმოსადგენად და საჭიროა მეტი დროის წერტილის დაყენება ყველა სიგნალის ცვლილების უკეთ დასაკვირვებლად. მესამე, ქსოვილის სტრუქტურის ცვლილებები მართლაც ნათლად ჩანს ჰისტოლოგიური შეღებვით, მაგრამ ზოგიერთი სპეციალიზებული ტექნიკა უკეთ ავლენს მიკროსტრუქტურულ ცვლილებებს ამ მოდელში. მაგალითად, პოლარიზებული სინათლის მიკროსკოპია გამოყენებული იქნა კურდღლის მალთაშუა დისკებში ფიბროხრტილის წარმოქმნის გასაანალიზებლად45. NP-ს გრძელვადიანი ეფექტები MC-სა და მალთაშუა ფირფიტაზე შემდგომ შესწავლას საჭიროებს.
ორმოცდათოთხმეტი მამრი ახალი ზელანდიის თეთრი კურდღელი (წონა დაახლოებით 2.5-3 კგ, ასაკი 3-3.5 თვე) შემთხვევითობის პრინციპით დაიყო ფიქტიური ოპერაციის ჯგუფად, კუნთების იმპლანტაციის ჯგუფად (ME ჯგუფი) და ნერვული ფესვის იმპლანტაციის ჯგუფად (NPE ჯგუფი). ყველა ექსპერიმენტული პროცედურა დამტკიცებული იყო ტიანძინის საავადმყოფოს ეთიკის კომიტეტის მიერ და ექსპერიმენტული მეთოდები ჩატარდა დამტკიცებული სახელმძღვანელო პრინციპების მკაცრი დაცვით.
S. Sobajima-ს 46 ქირურგიულ ტექნიკაში გარკვეული გაუმჯობესება შევიდა. თითოეული კურდღელი მოთავსდა ლატერალურ მწოლიარე მდგომარეობაში და ხუთი წელის მალთაშუა დისკის (IVD) წინა ზედაპირი გამოიფინა პოსტეროლატერალური რეტროპერიტონეალური მიდგომის გამოყენებით. თითოეულ კურდღელს ჩაუტარდა ზოგადი ანესთეზია (20% ურეთანი, 5 მლ/კგ ყურის ვენის მეშვეობით). კანის გრძივი ჭრილობა გაკეთდა ნეკნების ქვედა კიდიდან მენჯის კიდემდე, პარავერტებრული კუნთებისგან 2 სმ ვენტრალურად. მარჯვენა წინა-ლატერალური ხერხემალი L1-დან L6-მდე გამოიფინა კანქვეშა ქსოვილის, რეტროპერიტონეალური ქსოვილის და კუნთების ბასრი და ბლაგვი დისექციის გამოყენებით (სურ. 6A). დისკის დონე განისაზღვრა მენჯის კიდეს გამოყენებით, როგორც L5-L6 დისკის დონის ანატომიური ორიენტირი. გამოიყენეთ 16-კალიბრიანი პუნქციური ნემსი L5 მალის ბოლო ფირფიტასთან ახლოს 3 მმ სიღრმეზე ხვრელის გასაბურღად (სურ. 6B). 5 მლ შპრიცის გამოყენებით, მალთაშუა დისკის L1-L2 ნაწილებში აუტოლოგიური პულპოზური ბირთვის ასპირაცია უნდა მოხდეს (სურ. 6C). თითოეული ჯგუფის მოთხოვნების შესაბამისად, ამოიღეთ პულპოზური ბირთვი ან კუნთი. გაბურღული ხვრელის გაღრმავების შემდეგ, ღრმა ფასციაზე, ზედაპირულ ფასციასა და კანზე იდგმება შთამნთქმელი ნაკერი, ოპერაციის დროს ხერხემლის სხეულის პერიოსტალური ქსოვილის დაზიანების თავიდან ასაცილებლად.
(ა) L5–L6 დისკი გამოიკვეთება პოსტეროლატერალური რეტროპერიტონეალური მიდგომით. (ბ) L5 ბოლო ფირფიტასთან ახლოს ხვრელის გასაბურღად გამოიყენეთ 16-კალიბრიანი ნემსი. (გ) აუტოლოგიური MF-ები ამოღებულია.
ზოგადი ანესთეზია ჩატარდა ყურის ვენის მეშვეობით შეყვანილი 20%-იანი ურეთანით (5 მლ/კგ), ხოლო წელის ხერხემლის რენტგენოგრაფია განმეორდა ოპერაციიდან 12, 16 და 20 კვირის შემდეგ.
კურდღლები დაიღუპნენ კეტამინის (25.0 მგ/კგ) კუნთშიდა ინექციით და ნატრიუმის პენტობარბიტალის (1.2 გ/კგ) ინტრავენური შეყვანით ოპერაციიდან 12, 16 და 20 კვირის შემდეგ. ჰისტოლოგიური ანალიზისთვის მთლიანად ამოიღეს ხერხემალი და ჩატარდა რეალური ანალიზი. იმუნური ფაქტორების ცვლილებების დასადგენად გამოყენებული იქნა რაოდენობრივი უკუ ტრანსკრიფცია (RT-qPCR) და ვესტერნ ბლოტინგი.
კურდღლებში მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის (MRI) გამოკვლევები ჩატარდა 3.0 T კლინიკური მაგნიტის (GE Medical Systems, Florence, SC) გამოყენებით, რომელიც აღჭურვილი იყო ორთოგონალური კიდურის სპირალის მიმღებით. კურდღლებს ანესთეზია ჩაუტარდათ 20%-იანი ურეთანით (5 მლ/კგ) ყურის ვენის მეშვეობით და შემდეგ მოათავსეს მაგნიტში ზურგზე, წელის არეში 5 დიუმიანი დიამეტრის წრიული ზედაპირის სპირალის ცენტრით (GE Medical Systems). წელის დისკის მდებარეობის დასადგენად L3–L4-დან L5–L6-მდე მიღებული იქნა კორონარული T2-შეწონილი ლოკალიზაციის გამოსახულებები (TR, 1445 ms; TE, 37 ms). საგიტალური სიბრტყის T2-შეწონილი ნაჭრები მიღებული იქნა შემდეგი პარამეტრებით: სწრაფი სპინ-ექოს თანმიმდევრობა 2200 ms გამეორების დროით (TR) და 70 ms ექოს დროით (TE), მატრიცა; 260 მხედველობის ველი და რვა სტიმული; ჭრის სისქე იყო 2 მმ, უფსკრული იყო 0.2 მმ.
ბოლო ფოტოს გადაღების და ბოლო კურდღლის დაკვლის შემდეგ, ფიქტიური, კუნთში ჩანერგილი და NP დისკები ამოიღეს ჰისტოლოგიური გამოკვლევისთვის. ქსოვილები 1 კვირის განმავლობაში დააფიქსირეს 10%-იან ნეიტრალურ ბუფერულ ფორმალინში, დეკალციფიკაცია მოახდინეს ეთილენდიამინტეტრაძმარმჟავით და პარაფინით დაჭრეს. ქსოვილის ბლოკები პარაფინში ჩანერგეს და მიკროტომის გამოყენებით საგიტალურ ნაჭრებად (5 მკმ სისქის) დაჭრეს. ნაჭრები შეღებეს ჰემატოქსილინით და ეოზინით (H&E).
თითოეული ჯგუფის კურდღლებისგან მალთაშუა დისკების შეგროვების შემდეგ, მწარმოებლის ინსტრუქციისა და ImProm II უკუტრანსკრიფციის სისტემის (Promega Inc., მედისონი, ვისკონსინი, აშშ) მიხედვით, მთლიანი რნმ ექსტრაგირებული იქნა UNIQ-10 სვეტის (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., ჩინეთი) გამოყენებით. ჩატარდა უკუტრანსკრიფცია.
RT-qPCR ჩატარდა Prism 7300-ის (Applied Biosystems Inc., აშშ) და SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix-ის (Sigma-Aldrich, სენტ-ლუისი, მისური, აშშ) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. PCR რეაქციის მოცულობა იყო 20 μl და შეიცავდა 1.5 μl განზავებულ cDNA-ს და თითოეული პრაიმერის 0.2 μM-ს. პრაიმერები შეიმუშავა OligoPerfect Designer-მა (Invitrogen, ვალენსია, კალიფორნია) და წარმოებულია Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd.-ის (ჩინეთი) მიერ (ცხრილი 1). გამოყენებული იქნა შემდეგი თერმული ციკლის პირობები: საწყისი პოლიმერაზას აქტივაციის საფეხური 94°C-ზე 2 წუთის განმავლობაში, შემდეგ 40 ციკლი, თითოეული 15 წამიანი 94°C-ზე მატრიცის დენატურაციისთვის, გახურება 1 წუთის განმავლობაში 60°C-ზე, გაფართოება და ფლუორესცენცია. გაზომვები ჩატარდა 1 წუთის განმავლობაში 72°C-ზე. ყველა ნიმუში სამჯერ იქნა ამპლიფიცირებული და საშუალო მნიშვნელობა გამოყენებული იქნა RT-qPCR ანალიზისთვის. ამპლიფიკაციის მონაცემები გაანალიზდა FlexStation 3-ის გამოყენებით (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, აშშ). IL-4, IL-17 და IFN-γ გენის ექსპრესია ნორმალიზებული იყო ენდოგენური კონტროლის (ACTB) მიმართ. სამიზნე mRNA-ს ფარდობითი ექსპრესიის დონეები გამოითვალა 2-ΔΔCT მეთოდის გამოყენებით.
ქსოვილებიდან მთლიანი ცილა ამოღებული იქნა ქსოვილის ჰომოგენიზატორის გამოყენებით RIPA ლიზისის ბუფერში (შეიცავდა პროტეაზას და ფოსფატაზას ინჰიბიტორების კოქტეილს) და შემდეგ ცენტრიფუგირდა 13,000 ბრ/წთ-ზე 20 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე ქსოვილის ნარჩენების მოსაშორებლად. თითო ზოლში ჩაიტვირთა ცილის ორმოცდაათი მიკროგრამი, გამოყოფილი 10%-იანი SDS-PAGE-ით და შემდეგ გადატანილი იქნა PVDF მემბრანაზე. ბლოკირება განხორციელდა 5%-იან უცხიმო მშრალ რძეში Tris-ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (TBS), რომელიც შეიცავდა 0.1% Tween 20-ს, 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. მემბრანა ინკუბირებული იქნა კურდღლის ანტიდეკორინის პირველად ანტისხეულთან (განზავებული 1:200; ბოსტერი, ვუჰანი, ჩინეთი) (განზავებული 1:200; Bioss, პეკინი, ჩინეთი) მთელი ღამის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე და რეაქციაში შევიდა მეორე დღეს; მეორადი ანტისხეულით (თხის ანტი-კურდღლის იმუნოგლობულინ G 1:40,000 განზავებით) კომბინირებული ხრენის პეროქსიდაზასთან (ბოსტერი, ვუჰანი, ჩინეთი) 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. Western blot სიგნალები აღმოჩენილი იქნა რენტგენის დასხივების შემდეგ ქემილუმინესცენტურ მემბრანაზე გაზრდილი ქემილუმინესცენციით. დენსიტომეტრიული ანალიზისთვის, ბლოტები დასკანირებული და რაოდენობრივი განსაზღვრული იქნა BandScan პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით და შედეგები გამოხატული იყო სამიზნე გენის იმუნორეაქტიულობისა და ტუბულინის იმუნორეაქტიულობის თანაფარდობით.
სტატისტიკური გამოთვლები ჩატარდა SPSS16.0 პროგრამული პაკეტის (SPSS, აშშ) გამოყენებით. კვლევის დროს შეგროვებული მონაცემები გამოისახა საშუალო ± სტანდარტული გადახრის სახით (საშუალო ± სტანდარტული გადახრა) და გაანალიზდა ცალმხრივი განმეორებითი გაზომვების ანალიზის (ANOVA) გამოყენებით ორ ჯგუფს შორის განსხვავებების დასადგენად. P < 0.05 სტატისტიკურად მნიშვნელოვნად ჩაითვალა.
ამგვარად, MC-ის ცხოველური მოდელის შექმნა ხერხემლის სხეულში აუტოლოგიური ნანონაწილაკების იმპლანტაციით და მაკროანატომიური დაკვირვების, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის ანალიზის, ჰისტოლოგიური შეფასებისა და მოლეკულურ-ბიოლოგიური ანალიზის ჩატარებით, შეიძლება გახდეს მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტი ადამიანის MC-ის მექანიზმების შეფასებისა და გაგებისთვის, ასევე ახალი თერაპიული ჩარევების შემუშავებისთვის.
როგორ მოვიყვანოთ ეს სტატია: ჰანი, ს. და სხვ. მოდიკის ცვლილებების ცხოველური მოდელი შეიქმნა წელის ხერხემლის სუბქონდრალურ ძვალში აუტოლოგიური ბირთვის პულპოზუსის იმპლანტაციით. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
ვაიშაუპტი, დ., ზანეტი, მ., ჰოდლერი, ჯ. და ბოოსი, ნ. წელის ხერხემლის მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია: დისკის თიაქრისა და შეკავების, ნერვული ფესვის კომპრესიის, ბოლო ფირფიტების ანომალიების და ფასეტის სახსრის ოსტეოართრიტის გავრცელება ასიმპტომურ მოხალისეებში. მაჩვენებელი. რადიოლოგია 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
კიაერი, პ., კორშოლმი, ლ., ბენდიქსი, თ., სორენსენი, ჯ.ს. და ლებოუფ-ედი, კ. მოდიჩის ცვლილებები და მათი კავშირი კლინიკურ მონაცემებთან. ევროპული ხერხემლის ჟურნალი: ევროპის ხერხემლის საზოგადოების, ხერხემლის დეფორმაციის ევროპული საზოგადოების და საშვილოსნოს ყელის ხერხემლის კვლევის ევროპული საზოგადოების ოფიციალური გამოცემა 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
კუისმა, მ. და სხვ. მოდიკის ცვლილებები წელის ხერხემლის ბოლო ფირფიტებში: გავრცელება და კავშირი წელის ტკივილთან და იშიაზთან საშუალო ასაკის მამაკაც მუშაკებში. ხერხემალი 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
დე რუსი, ა., კრესელი, ჰ., შპრიცერი, კ. და დალინკა, მ. წელის ხერხემლის დეგენერაციული დაავადების დროს ძვლის ტვინის ბოლო ფირფიტასთან ახლოს მდებარე ცვლილებების მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია. AJR. ამერიკული რადიოლოგიის ჟურნალი 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
მოდიჩი, მ.ტ., სტეინბერგი, პ.მ., როსი, ჯ.ს., მასარიკი, თ.ჯ. და კარტერი, ჯ.რ. ხერხემლის ძვლის ტვინის დეგენერაციული დაავადება: ხერხემლის ტვინის ცვლილებების შეფასება მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფიის გამოყენებით. რადიოლოგია 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
მოდიჩი, მ.ტ., მასარიკი, თ.ჯ., როსი, ჯ.ს. და კარტერი, ჯ.რ. დეგენერაციული დისკის დაავადების ვიზუალიზაცია. რადიოლოგია 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
იენსენი, თ.ს. და სხვ. ნეოვერტებრული ბოლო ფირფიტის (მოდიკის) სიგნალის ცვლილებების პროგნოზირების ფაქტორები ზოგად პოპულაციაში. ევროპული ხერხემლის ჟურნალი: ევროპის ხერხემლის საზოგადოების, ხერხემლის დეფორმაციის ევროპული საზოგადოების და საშვილოსნოს ყელის ხერხემლის კვლევის ევროპული საზოგადოების ოფიციალური პუბლიკაცია, მე-19 განყოფილება, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
ალბერტი, ჰ.ბ. და მანნიში, კ. მოდიჩის ცვლილებები წელის დისკის თიაქრის შემდეგ. ევროპული ხერხემლის ჟურნალი: ევროპული ხერხემლის საზოგადოების, ხერხემლის დეფორმაციის ევროპული საზოგადოების და საშვილოსნოს ყელის ხერხემლის კვლევის ევროპული საზოგადოების ოფიციალური პუბლიკაცია 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
კერტულა, ლ., ლუომა, კ., ვეჰმასი, თ., გრონბლადი, მ. და კააპა, ე. მოდიკის I ტიპის ცვლილებები შეიძლება პროგნოზირებდეს სწრაფად პროგრესირებად დეფორმაციულ დისკის დეგენერაციას: 1-წლიანი პერსპექტიული კვლევა. ევროპული ხერხემლის ჟურნალი 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
ჰუ, ზ.ჯ., ჟაო, ფ.დ., ფანგი, ს.ქ. და ფანი, ს.ვ. მოდიკის ცვლილებები: შესაძლო მიზეზები და წელის დისკის დეგენერაციაში წვლილი. სამედიცინო ჰიპოთეზები 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
კროკი, ჰ.ვ. დისკის შიდა გახეთქვი. დისკის პროლაფსის პრობლემები 50 წელზე მეტი ხნის განმავლობაში. ხერხემალი (ფილა, პენსილვანია 1976) 11, 650–653 (1986).