აუტოლოგიური ბირთვი პულპოზური იმპლანტირებულია წელის სუბქონდრულ ძვალში მოდური ცვლილებების ცხოველური მოდელის შესაქმნელად

გმადლობთ Nature.com-ის მონახულებისთვის. ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა. საუკეთესო შედეგისთვის, ჩვენ გირჩევთ გამოიყენოთ უფრო ახალი ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ გამოვაჩენთ საიტს სტილის და JavaScript-ის გარეშე.
მოდიკური ცვლილების ცხოველური მოდელების (MC) დამკვიდრება მნიშვნელოვანი საფუძველია MC-ის შესწავლისთვის. ორმოცდათოთხმეტი ახალი ზელანდიის თეთრი კურდღელი დაყოფილი იყო შამ-ოპერაციის ჯგუფად, კუნთების იმპლანტაციის ჯგუფად (ME ჯგუფი) და ბირთვის პულპოსუსის იმპლანტაციის ჯგუფად (NPE ჯგუფი). NPE ჯგუფში, მალთაშუა დისკი გამოიკვეთა ანტეროლატერალური წელის ქირურგიული მიდგომით და გამოყენებული იქნა ნემსი L5 ხერხემლის სხეულის ბოლო ფირფიტის მახლობლად პუნქციისთვის. NP ამოიღეს L1/2 მალთაშუა დისკიდან შპრიცით და შეიყვანეს მასში. ხვრელის გაბურღვა სუბქონდრულ ძვალში. ქირურგიული პროცედურები და ბურღვის მეთოდები კუნთების იმპლანტაციის ჯგუფში და შამ-ოპერაციის ჯგუფში იგივე იყო, რაც NP იმპლანტაციის ჯგუფში. ME ჯგუფში კუნთის ნაჭერი იყო მოთავსებული ხვრელში, ხოლო შამ-ოპერაციულ ჯგუფში ხვრელში არაფერი იყო მოთავსებული. ოპერაციის შემდეგ ჩატარდა MRI სკანირება და მოლეკულური ბიოლოგიური ტესტირება. სიგნალი NPE ჯგუფში შეიცვალა, მაგრამ არ იყო აშკარა სიგნალის ცვლილება შამ-ოპერაციულ ჯგუფში და ME ჯგუფში. ჰისტოლოგიურმა დაკვირვებამ აჩვენა, რომ ქსოვილის პათოლოგიური პროლიფერაცია შეინიშნებოდა იმპლანტაციის ადგილზე და IL-4, IL-17 და IFN-γ გაიზარდა NPE ჯგუფში. NP-ის იმპლანტაცია სუბქონდრულ ძვალში შეიძლება შექმნას MC-ის ცხოველური მოდელი.
მოდური ცვლილებები (MC) არის ხერხემლის ბოლო ფირფიტების და მიმდებარე ძვლის ტვინის დაზიანებები, რომლებიც ჩანს მაგნიტურ-რეზონანსულ ტომოგრაფიაზე (MRI). ისინი საკმაოდ ხშირია ასოცირებული სიმპტომების მქონე პირებში1. ბევრმა კვლევამ ხაზგასმით აღნიშნა MC-ის მნიშვნელობა წელის ტკივილთან (LBP) 2,3 კავშირის გამო. de Roos et al.4 და Modic et al.5 დამოუკიდებლად პირველად აღწერეს სამი სხვადასხვა ტიპის სუბქონდრალური სიგნალის ანომალიები ხერხემლის ძვლის ტვინში. Modic ტიპის I ცვლილებები ჰიპოინტენსიურია T1-წონიან (T1W) თანმიმდევრობებზე და ჰიპერინტენსიური T2-წონიან (T2W) თანმიმდევრობებზე. ეს დაზიანება ავლენს ნაპრალის ბოლო ფირფიტებს და მიმდებარე სისხლძარღვთა გრანულაციის ქსოვილს ძვლის ტვინში. Modic ტიპის II ცვლილებები აჩვენებს მაღალ სიგნალს ორივე T1W და T2W თანმიმდევრობებზე. ამ ტიპის დაზიანებისას შეიძლება აღმოჩნდეს ბოლო ფირფიტის დესტრუქცია, აგრეთვე მიმდებარე ძვლის ტვინის ჰისტოლოგიური ცხიმოვანი ჩანაცვლება. მოდიკური ტიპის III ცვლილებები აჩვენებს დაბალ სიგნალს T1W და T2W თანმიმდევრობებში. დაფიქსირდა ბოლო ფირფიტების შესაბამისი სკლეროზული დაზიანებები6. MC ითვლება ხერხემლის პათოლოგიურ დაავადებად და მჭიდრო კავშირშია ხერხემლის ბევრ დეგენერაციულ დაავადებასთან7,8,9.
არსებული მონაცემების გათვალისწინებით, რამდენიმე კვლევამ მოგვაწოდა დეტალური ინფორმაცია MC-ის ეტიოლოგიისა და პათოლოგიური მექანიზმების შესახებ. ალბერტმა და სხვებმა. ვარაუდობს, რომ MC შეიძლება გამოწვეული იყოს დისკის თიაქრით8. ჰუ და სხვ. მიეწერება MC მძიმე დისკის დეგენერაციას10. კროკმა შემოგვთავაზა კონცეფცია "შიდა დისკის რღვევის", რომელშიც ნათქვამია, რომ დისკის განმეორებითმა ტრავმამ შეიძლება გამოიწვიოს მიკროტირეები ბოლო ფირფიტაში. ნაპრალის წარმოქმნის შემდეგ, ბოლო ფირფიტის განადგურებამ ბირთვის პულპოსუსით (NP) შეიძლება გამოიწვიოს აუტოიმუნური პასუხი, რაც შემდგომში იწვევს MC11-ის განვითარებას. მა და სხვ. იზიარებდა მსგავს შეხედულებას და იტყობინება, რომ NP-ით გამოწვეული აუტოიმუნიტეტი თამაშობს მთავარ როლს MC12-ის პათოგენეზში.
იმუნური სისტემის უჯრედები, განსაკუთრებით CD4+ T დამხმარე ლიმფოციტები, გადამწყვეტ როლს თამაშობენ აუტოიმუნურობის პათოგენეზში13. ახლახან აღმოჩენილი Th17 ქვეჯგუფი აწარმოებს ანთების საწინააღმდეგო ციტოკინს IL-17, ხელს უწყობს ქიმიოკინის ექსპრესიას და ასტიმულირებს დაზიანებულ ორგანოებში T უჯრედებს IFN-γ14-ის წარმოებისთვის. Th2 უჯრედები ასევე თამაშობენ უნიკალურ როლს იმუნური რეაქციების პათოგენეზში. IL-4-ის, როგორც წარმომადგენლობითი Th2 უჯრედის გამოხატვამ შეიძლება გამოიწვიოს მძიმე იმუნოპათოლოგიური შედეგები15.
მიუხედავად იმისა, რომ მრავალი კლინიკური კვლევა ჩატარდა MC16,17,18,19,20,21,22,23,24-ზე, ჯერ კიდევ არ არის შესაფერისი ცხოველთა ექსპერიმენტული მოდელების ნაკლებობა, რომლებიც შეიძლება მიბაძონ MC პროცესს, რომელიც ხშირად ხდება ადამიანებში და შეიძლება იყოს გამოიყენება ეტიოლოგიის ან ახალი მკურნალობის გამოსაკვლევად, როგორიცაა მიზნობრივი თერაპია. დღეისათვის, MC-ის მხოლოდ რამდენიმე ცხოველური მოდელია მოხსენებული, რომ შეისწავლეს ფუძემდებლური პათოლოგიური მექანიზმები.
ალბერტისა და მა-ს მიერ შემოთავაზებული აუტოიმუნური თეორიის საფუძველზე, ამ კვლევამ დაადგინა კურდღლის MC მოდელის მარტივი და რეპროდუქცია NP-ის ავტოტრანსპლანტაციის გზით გაბურღული ხერხემლის ბოლო ფირფიტასთან. სხვა მიზნებია ცხოველური მოდელების ჰისტოლოგიური მახასიათებლების დაკვირვება და ნპ-ის სპეციფიკური მექანიზმების შეფასება MC-ის განვითარებაში. ამ მიზნით, ჩვენ ვიყენებთ ტექნიკას, როგორიცაა მოლეკულური ბიოლოგია, MRI და ჰისტოლოგიური კვლევები MC-ის პროგრესირების შესასწავლად.
ორი კურდღელი გარდაიცვალა სისხლდენით ოპერაციის დროს, ხოლო ოთხი კურდღელი გარდაიცვალა ანესთეზიის დროს MRI-ს დროს. დარჩენილი 48 კურდღელი გადარჩა და ოპერაციის შემდეგ არ აჩვენა ქცევითი ან ნევროლოგიური ნიშნები.
MRI აჩვენებს, რომ სხვადასხვა ხვრელში ჩანერგილი ქსოვილის სიგნალის ინტენსივობა განსხვავებულია. L5 ხერხემლის სხეულის სიგნალის ინტენსივობა NPE ჯგუფში თანდათან იცვლებოდა ჩასვლიდან 12, 16 და 20 კვირაში (T1W თანმიმდევრობა აჩვენებდა დაბალ სიგნალს და T2W თანმიმდევრობა აჩვენებდა შერეულ სიგნალს პლუს დაბალი სიგნალი) (ნახ. 1C), ხოლო MRI გამოვლინებები ჩაშენებული ნაწილების დანარჩენი ორი ჯგუფი შედარებით სტაბილური დარჩა იმავე პერიოდის განმავლობაში (ნახ. 1A, B).
(A) კურდღლის წელის ხერხემლის წარმომადგენლობითი თანმიმდევრული MRI 3 დროის მომენტში. შამ-ოპერაციული ჯგუფის სურათებში სიგნალის დარღვევები არ აღმოჩნდა. (B) ხერხემლის სხეულის სიგნალის მახასიათებლები ME ჯგუფში მსგავსია შამ-ოპერაციის ჯგუფში და მნიშვნელოვანი სიგნალის ცვლილება არ შეინიშნება ჩანერგვის ადგილზე დროთა განმავლობაში. (C) NPE ჯგუფში დაბალი სიგნალი აშკარად ჩანს T1W თანმიმდევრობაში, ხოლო შერეული სიგნალი და დაბალი სიგნალი აშკარად ჩანს T2W თანმიმდევრობაში. 12-კვირიანი პერიოდიდან 20-კვირიან პერიოდამდე, T2W თანმიმდევრობით დაბალი სიგნალების გარშემო სპორადული მაღალი სიგნალები მცირდება.
აშკარა ძვლის ჰიპერპლაზია ჩანს ხერხემლის სხეულის იმპლანტაციის ადგილზე NPE ჯგუფში და ძვლის ჰიპერპლაზია უფრო სწრაფად ხდება 12-დან 20 კვირამდე (ნახ. 2C) NPE ჯგუფთან შედარებით, მოდელირებულ ხერხემლიანში მნიშვნელოვანი ცვლილება არ შეინიშნება. სხეულები; შამ ჯგუფი და ME ჯგუფი (ნახ. 2C) 2A,B).
(ა) ხერხემლის სხეულის ზედაპირი იმპლანტირებული ნაწილზე ძალიან გლუვია, ხვრელი კარგად კურნავს და არ არის ჰიპერპლაზია ხერხემლის სხეულში. (B) იმპლანტირებული ადგილის ფორმა ME ჯგუფში მსგავსია იმპლანტირებული საოპერაციო ჯგუფში და არ არის აშკარა ცვლილება იმპლანტირებული ადგილის გარეგნობაში დროთა განმავლობაში. (C) ძვლის ჰიპერპლაზია მოხდა იმპლანტირებული ადგილზე NPE ჯგუფში. ძვლის ჰიპერპლაზია სწრაფად გაიზარდა და ვრცელდებოდა კიდეც მალთაშუა დისკის მეშვეობით კონტრალატერალურ ხერხემლის სხეულამდე.
ჰისტოლოგიური ანალიზი გვაწვდის უფრო დეტალურ ინფორმაციას ძვლის ფორმირების შესახებ. სურათი 3 გვიჩვენებს პოსტოპერაციული სექციების ფოტოსურათებს, რომლებიც შეღებილია H&E-ით. მოჩვენებითი ოპერაციების ჯგუფში, ქონდროციტები კარგად იყო განლაგებული და არ იყო გამოვლენილი უჯრედების პროლიფერაცია (ნახ. 3A). ME ჯგუფში ვითარება მსგავსი იყო შამ-ოპერაციის ჯგუფში (ნახ. 3B). თუმცა, NPE ჯგუფში, ქონდროციტების დიდი რაოდენობა და NP-ის მსგავსი უჯრედების პროლიფერაცია დაფიქსირდა იმპლანტაციის ადგილზე (ნახ. 3C);
(A) ტრაბეკულები ჩანს ბოლო ფირფიტასთან ახლოს, ქონდროციტები მოწესრიგებულად არის მოწყობილი უჯრედის ერთიანი ზომითა და ფორმით და არ არის გამრავლებული (40-ჯერ). (B) იმპლანტაციის ადგილის მდგომარეობა ME ჯგუფში მსგავსია შამ ჯგუფის მდგომარეობის. ჩანს ტრაბეკულები და ქონდროციტები, მაგრამ იმპლანტაციის ადგილზე აშკარა პროლიფერაცია არ არის (40-ჯერ). (B) ჩანს, რომ ქონდროციტები და NP-ის მსგავსი უჯრედები მნიშვნელოვნად მრავლდება, ხოლო ქონდროციტების ფორმა და ზომა არათანაბარია (40-ჯერ).
ინტერლეუკინ 4 (IL-4) mRNA, ინტერლეუკინ 17 (IL-17) mRNA და ინტერფერონის γ (IFN-γ) mRNA-ს ექსპრესია დაფიქსირდა როგორც NPE, ასევე ME ჯგუფში. როდესაც შედარებულია სამიზნე გენების ექსპრესიის დონეები, IL-4, IL-17 და IFN-γ გენური ექსპრესიები მნიშვნელოვნად გაიზარდა NPE ჯგუფში ME ჯგუფისა და მოჩვენებითი ოპერაციის ჯგუფთან შედარებით (ნახ. 4). (P <0.05). მოჩვენებითი საოპერაციო ჯგუფთან შედარებით, IL-4, IL-17 და IFN-γ გამოხატვის დონეები ME ჯგუფში მხოლოდ ოდნავ გაიზარდა და არ მიაღწია სტატისტიკურ ცვლილებას (P > 0.05).
IL-4, IL-17 და IFN-γ-ის mRNA გამოხატულებამ NPE ჯგუფში აჩვენა მნიშვნელოვნად მაღალი ტენდენცია, ვიდრე აბსტრაქტული ოპერაციის ჯგუფში და ME ჯგუფში (P <0.05).
ამის საპირისპიროდ, გამოხატვის დონე ME ჯგუფში არ აჩვენა მნიშვნელოვანი განსხვავება (P>0.05).
Western blot ანალიზი ჩატარდა კომერციულად ხელმისაწვდომი ანტისხეულების გამოყენებით IL-4 და IL-17, რათა დაადასტუროთ შეცვლილი mRNA გამოხატვის ნიმუში. როგორც ნაჩვენებია ნახატებში 5A,B, ME ჯგუფთან და მოჩვენებითი ოპერაციის ჯგუფთან შედარებით, IL-4 და IL-17 ცილის დონეები NPE ჯგუფში მნიშვნელოვნად გაიზარდა (P <0.05). მოჩვენებითი ოპერაციის ჯგუფთან შედარებით, IL-4 და IL-17 ცილის დონემ ME ჯგუფში ასევე ვერ მიაღწია სტატისტიკურად მნიშვნელოვან ცვლილებებს (P> 0.05).
(A) IL-4 და IL-17 ცილის დონეები NPE ჯგუფში მნიშვნელოვნად მაღალი იყო ვიდრე ME ჯგუფში და პლაცებო ჯგუფში (P <0.05). (B) Western blot ჰისტოგრამა.
ოპერაციის დროს მიღებული ადამიანის ნიმუშების შეზღუდული რაოდენობის გამო, MC-ის პათოგენეზის მკაფიო და დეტალური შესწავლა გარკვეულწილად რთულია. ჩვენ შევეცადეთ დაგვედგინა MC-ის ცხოველური მოდელი მისი პოტენციური პათოლოგიური მექანიზმების შესასწავლად. ამავდროულად, რენტგენოლოგიური შეფასება, ჰისტოლოგიური შეფასება და მოლეკულური ბიოლოგიური შეფასება გამოიყენებოდა NP ავტოტრანსპლანტატით ინდუცირებული MC-ის კურსის გასაკონტროლებლად. შედეგად, NP იმპლანტაციის მოდელმა გამოიწვია სიგნალის ინტენსივობის თანდათანობითი ცვლილება 12-კვირიდან 20-კვირიან დროში (შერეული დაბალი სიგნალი T1W თანმიმდევრობებში და დაბალი სიგნალი T2W თანმიმდევრობებში), რაც მიუთითებს ქსოვილის ცვლილებებზე და ჰისტოლოგიურ და მოლეკულურზე. ბიოლოგიურმა შეფასებებმა დაადასტურა რადიოლოგიური კვლევის შედეგები.
ამ ექსპერიმენტის შედეგები აჩვენებს, რომ ვიზუალური და ჰისტოლოგიური ცვლილებები მოხდა ხერხემლის სხეულის დაზიანების ადგილზე NPE ჯგუფში. ამავდროულად, დაფიქსირდა IL-4, IL-17 და IFN-γ გენების, ასევე IL-4, IL-17 და IFN-γ გამოხატულება, რაც მიუთითებს, რომ აუტოლოგიური ბირთვის პულპოსუსის ქსოვილის დარღვევა ხერხემლის არეში. სხეულმა შეიძლება გამოიწვიოს რიგი სიგნალი და მორფოლოგიური ცვლილებები. ადვილია იმის დადგენა, რომ ცხოველური მოდელის ხერხემლის სხეულების სიგნალის მახასიათებლები (დაბალი სიგნალი T1W თანმიმდევრობით, შერეული სიგნალი და დაბალი სიგნალი T2W თანმიმდევრობით) ძალიან ჰგავს ადამიანის ხერხემლის უჯრედებს, ასევე MRI მახასიათებლები. დაადასტურეთ ჰისტოლოგიური და მთლიანი ანატომიის დაკვირვებები, ანუ ხერხემლის სხეულის უჯრედებში ცვლილებები პროგრესირებადია. მიუხედავად იმისა, რომ მწვავე ტრავმით გამოწვეული ანთებითი პასუხი შეიძლება გამოჩნდეს პუნქციის შემდეგ მალევე, MRI-ის შედეგებმა აჩვენა, რომ თანდათან მზარდი სიგნალის ცვლილებები ჩნდებოდა პუნქციის შემდეგ 12 კვირაში და გაგრძელდა 20 კვირამდე აღდგენის ნიშნების ან MRI ცვლილებების შებრუნების გარეშე. ეს შედეგები ვარაუდობს, რომ ხერხემლის აუტოლოგიური NP არის საიმედო მეთოდი კურდღლებში პროგრესული MV-ის დასადგენად.
პუნქციის ეს მოდელი მოითხოვს ადეკვატურ უნარს, დროს და ქირურგიულ ძალისხმევას. წინასწარი ექსპერიმენტების დროს, პარავერტებრული ლიგამენტური სტრუქტურების დისექციამ ან გადაჭარბებულმა სტიმულაციამ შეიძლება გამოიწვიოს ხერხემლის ოსტეოფიტების წარმოქმნა. სიფრთხილეა საჭირო, რომ არ დაზიანდეს ან გაღიზიანდეს მიმდებარე დისკები. იმის გამო, რომ შეღწევადობის სიღრმე უნდა იყოს კონტროლირებადი, რათა მივიღოთ თანმიმდევრული და გამეორებადი შედეგები, ჩვენ ხელით გავაკეთეთ შტეფსელი 3 მმ სიგრძის ნემსის გარსით. ამ დანამატის გამოყენება უზრუნველყოფს ხერხემლის სხეულში ბურღვის ერთგვაროვან სიღრმეს. წინასწარი ექსპერიმენტების დროს, ოპერაციაში ჩართულმა სამმა ორთოპედმა 16-ლიანდაგიანი ნემსით მუშაობა უფრო ადვილი აღმოჩნდა, ვიდრე 18-ლიანდაგიანი ნემსით ან სხვა მეთოდებით. ბურღვის დროს გადაჭარბებული სისხლდენის თავიდან ასაცილებლად, ნემსის გარკვეული ხნით უძრავად დაჭერა უზრუნველყოფს უფრო შესაფერის ხვრელს, რაც ვარაუდობს, რომ MC-ის გარკვეული ხარისხი შეიძლება ამ გზით კონტროლდებოდეს.
მიუხედავად იმისა, რომ მრავალი კვლევა მიზნად ისახავს MC-ს, ცოტა რამ არის ცნობილი MC25,26,27-ის ეტიოლოგიისა და პათოგენეზის შესახებ. ჩვენს წინა კვლევებზე დაყრდნობით, ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ აუტოიმუნიტეტი მნიშვნელოვან როლს ასრულებს MC12-ის წარმოქმნასა და განვითარებაში. ამ კვლევამ შეისწავლა IL-4, IL-17 და IFN-γ რაოდენობრივი გამოხატულება, რომლებიც წარმოადგენს CD4+ უჯრედების დიფერენციაციის ძირითად გზას ანტიგენის სტიმულაციის შემდეგ. ჩვენს კვლევაში, ნეგატიურ ჯგუფთან შედარებით, NPE ჯგუფს ჰქონდა IL-4, IL-17 და IFN-γ უფრო მაღალი გამოხატულება და IL-4 და IL-17 ცილის დონეები ასევე უფრო მაღალი იყო.
კლინიკურად, IL-17 mRNA ექსპრესია გაიზარდა NP უჯრედებში დისკის თიაქრის მქონე პაციენტებისგან28. გაზრდილი IL-4 და IFN-γ ექსპრესიის დონე ასევე დაფიქსირდა მწვავე არაკომპრესიული დისკის თიაქრის მოდელში ჯანმრთელ კონტროლთან შედარებით29. IL-17 მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ანთებაში, ქსოვილის დაზიანებაში აუტოიმუნურ დაავადებებში30 და აძლიერებს იმუნურ პასუხს IFN-γ31-ზე. გაძლიერებული IL-17-ით გამოწვეული ქსოვილის დაზიანება დაფიქსირდა MRL/lpr თაგვებში32 და აუტოიმუნური მგრძნობიარე თაგვებში33. IL-4-ს შეუძლია დათრგუნოს პროანთებითი ციტოკინების (როგორიცაა IL-1β და TNFα) ექსპრესია და მაკროფაგების აქტივაცია34. მოხსენებული იყო, რომ IL-4-ის mRNA გამოხატულება განსხვავებული იყო NPE ჯგუფში IL-17-თან და IFN-γ-თან შედარებით ამავე დროს; IFN-γ-ის mRNA გამოხატულება NPE ჯგუფში მნიშვნელოვნად მაღალი იყო, ვიდრე სხვა ჯგუფებში. ამიტომ, IFN-γ წარმოება შეიძლება იყოს ანთებითი პასუხის შუამავალი, რომელიც გამოწვეულია NP ინტერკალაციით. კვლევებმა აჩვენა, რომ IFN-γ წარმოიქმნება მრავალი ტიპის უჯრედის მიერ, მათ შორის გააქტიურებული ტიპის 1 დამხმარე T უჯრედები, ბუნებრივი მკვლელი უჯრედები და მაკროფაგები35,36 და არის ძირითადი ანთების საწინააღმდეგო ციტოკინი, რომელიც ხელს უწყობს იმუნურ პასუხებს37.
ეს კვლევა ვარაუდობს, რომ აუტოიმუნური პასუხი შეიძლება იყოს ჩართული MC-ის წარმოქმნასა და განვითარებაში. ლუომა და სხვ. აღმოაჩინა, რომ MC და გამოჩენილი NP-ის სიგნალის მახასიათებლები მსგავსია MRI-ზე და ორივე აჩვენებს მაღალ სიგნალს T2W თანმიმდევრობაში38. ზოგიერთი ციტოკინი დადასტურებულია, რომ მჭიდრო კავშირშია MC-ის წარმოქმნასთან, როგორიცაა IL-139. მა და სხვ. ვარაუდობს, რომ NP-ის ზევით ან ქვევით პროტრუზიას შეიძლება ჰქონდეს დიდი გავლენა MC12-ის წარმოქმნასა და განვითარებაზე. Bobechko40 და Herzbein et al.41 იტყობინება, რომ NP არის იმუნოტოლერანტული ქსოვილი, რომელიც დაბადებიდან ვერ შედის სისხლძარღვთა ცირკულაციაში. NP პროტრუზია შემოაქვს უცხო სხეულებს სისხლის მიწოდებაში, რითაც შუამავლობს ადგილობრივ აუტოიმუნურ რეაქციებს42. აუტოიმუნურ რეაქციებს შეუძლია გამოიწვიოს იმუნური ფაქტორების დიდი რაოდენობა და როდესაც ეს ფაქტორები მუდმივად ექვემდებარება ქსოვილებს, მათ შეუძლიათ გამოიწვიონ ცვლილებები სიგნალში43. ამ კვლევაში, IL-4, IL-17 და IFN-γ ჭარბი გამოხატვა არის ტიპიური იმუნური ფაქტორები, რაც კიდევ უფრო ადასტურებს NP-სა და MCs44-ს შორის მჭიდრო კავშირს. ეს ცხოველური მოდელი კარგად მიბაძავს NP გარღვევას და ბოლო ფირფიტაში შესვლას. ამ პროცესმა შემდგომში გამოავლინა აუტოიმუნიტეტის გავლენა MC-ზე.
როგორც მოსალოდნელი იყო, ცხოველის ეს მოდელი გვაძლევს შესაძლო პლატფორმას MC-ის შესასწავლად. თუმცა, ამ მოდელს ჯერ კიდევ აქვს გარკვეული შეზღუდვები: პირველ რიგში, ცხოველებზე დაკვირვების ფაზაში, ზოგიერთი შუასაფეხურიანი კურდღლის ევთანაზია საჭიროა ჰისტოლოგიური და მოლეკულური ბიოლოგიის ტესტირებისთვის, ამიტომ ზოგიერთი ცხოველი დროთა განმავლობაში „გამოვარდება ხმარებიდან“. მეორეც, მიუხედავად იმისა, რომ ამ კვლევაში მითითებულია სამი დროის წერტილი, სამწუხაროდ, ჩვენ მხოლოდ ერთი ტიპის MC-ის მოდელირება მოვახდინეთ (Modic type I ცვლილება), ასე რომ, ეს საკმარისი არ არის ადამიანის დაავადების განვითარების პროცესის წარმოსაჩენად, და მეტი დროის წერტილები უნდა დაინიშნოს უკეთესად დააკვირდით სიგნალის ყველა ცვლილებას. მესამე, ქსოვილის სტრუქტურის ცვლილებები მართლაც ნათლად ჩანს ჰისტოლოგიური შეღებვით, მაგრამ ზოგიერთ სპეციალიზებულ ტექნიკას შეუძლია უკეთ გამოავლინოს მიკროსტრუქტურული ცვლილებები ამ მოდელში. მაგალითად, პოლარიზებული სინათლის მიკროსკოპია კურდღლის მალთაშუა დისკებში ფიბროკარტილაჟის წარმოქმნის გასაანალიზებლად45. NP-ის გრძელვადიანი ეფექტები MC-ზე და ბოლო ფირფიტაზე საჭიროებს შემდგომ შესწავლას.
ორმოცდათოთხმეტი მამრი ახალზელანდიელი თეთრი კურდღელი (წონა დაახლოებით 2.5-3 კგ, ასაკი 3-3.5 თვე) შემთხვევით დაყვეს მოჩვენებითი ოპერაციის ჯგუფად, კუნთების იმპლანტაციის ჯგუფად (ME ჯგუფი) და ნერვული ფესვის იმპლანტაციის ჯგუფად (NPE ჯგუფი). ყველა ექსპერიმენტული პროცედურა დამტკიცებული იყო ტიანჯინის საავადმყოფოს ეთიკის კომიტეტის მიერ და ექსპერიმენტული მეთოდები განხორციელდა დამტკიცებული გაიდლაინების მკაცრი დაცვით.
გარკვეული გაუმჯობესება განხორციელდა S. Sobajima-ს ქირურგიულ ტექნიკაში 46 . თითოეული კურდღელი მოთავსებული იყო გვერდითი დაწოლის მდგომარეობაში და ხუთი ზედიზედ წელის მალთაშუა დისკის (IVDs) წინა ზედაპირი გამოფენილი იყო პოსტეროლატერალური რეტროპერიტონეალური მიდგომის გამოყენებით. თითოეულ კურდღელს ჩაუტარდა ზოგადი ანესთეზია (20% ურეთანი, 5 მლ/კგ ყურის ვენის მეშვეობით). გაკეთდა კანის გრძივი ჭრილობა ნეკნების ქვედა კიდიდან მენჯის კიდემდე, 2 სმ ვენტრალიდან პარავერტებრულ კუნთებამდე. მარჯვენა ანტეროლატერალური ხერხემალი L1-დან L6-მდე გამოიკვეთა ზემოდან კანქვეშა ქსოვილის, რეტროპერიტონეალური ქსოვილის და კუნთების მკვეთრი და ბლაგვი ამოკვეთით (ნახ. 6A). დისკის დონე განისაზღვრა მენჯის კიდის გამოყენებით, როგორც ანატომიური საეტაპო L5-L6 დისკის დონისთვის. გამოიყენეთ 16 დიამეტრიანი პუნქციური ნემსი, რომ გაბურღოთ ხვრელი L5 ხერხემლის ბოლო ფირფიტასთან 3 მმ სიღრმეზე (ნახ. 6B). გამოიყენეთ 5 მლ შპრიცი L1-L2 მალთაშუა დისკში აუტოლოგიური ბირთვის ასპირაციისთვის (ნახ. 6C). ამოიღეთ პულპოსუსის ბირთვი ან კუნთი თითოეული ჯგუფის მოთხოვნების შესაბამისად. საბურღი ხვრელის გაღრმავების შემდეგ, აბსორბირებადი ნაკერები იდება ღრმა ფასციაზე, ზედაპირულ ფასციაზე და კანზე, ზრუნავს, რომ არ დაზიანდეს ხერხემლის სხეულის პერიოსტალური ქსოვილი ოპერაციის დროს.
(A) L5-L6 დისკი იხსნება პოსტეროლატერალური რეტროპერიტონეალური მიდგომის მეშვეობით. (B) გამოიყენეთ 16 მეტრიანი ნემსი, რომ გაბურღოთ ხვრელი L5 ბოლო ფირფიტასთან. (C) ავტოლოგური MF-ები გროვდება.
ზოგადი ანესთეზია ჩაუტარდა 20% ურეთანს (5 მლ/კგ) შეყვანილი ყურის ვენის მეშვეობით და წელის ხერხემლის რენტგენოგრაფია განმეორდა ოპერაციის შემდგომ 12, 16 და 20 კვირაში.
კურდღლები დაიღუპნენ კეტამინის (25.0 მგ/კგ) და ნატრიუმის პენტობარბიტალის (1.2 გ/კგ) ინტრამუსკულური ინექციით ოპერაციიდან 12, 16 და 20 კვირაში. ჰისტოლოგიური ანალიზისთვის ამოიღეს მთელი ხერხემალი და ჩაუტარდა რეალური ანალიზი. რაოდენობრივი საპირისპირო ტრანსკრიფცია (RT-qPCR) და Western blotting იყო გამოყენებული იმუნური ფაქტორების ცვლილებების გამოსავლენად.
MRI გამოკვლევები ჩატარდა კურდღლებში 3.0 T კლინიკური მაგნიტის გამოყენებით (GE Medical Systems, Florence, SC), რომელიც აღჭურვილი იყო კიდურის ორთოგონალური ხვეული მიმღებით. კურდღლებს გაუკეთეს ანესთეზირება 20% ურეთანით (5 მლ/კგ) ყურის ვენის მეშვეობით და შემდეგ მოათავსეს მწოლიარედ მაგნიტის შიგნით წელის არეში, რომელიც ორიენტირებული იყო 5 დიუმიანი დიამეტრის წრიულ ზედაპირზე ხვეულზე (GE Medical Systems). კორონალური T2 შეწონილი ლოკალიზატორის სურათები (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) შეძენილი იქნა წელის დისკის ადგილმდებარეობის დასადგენად L3-L4-დან L5-L6-მდე. საგიტალური სიბრტყის T2 წონიანი ნაჭრები შეძენილი იქნა შემდეგი პარამეტრებით: სწრაფი სპინ-ექოს თანმიმდევრობა გამეორების დროით (TR) 2200 ms და ექო დრო (TE) 70 ms, მატრიცა; ვიზუალური ველი 260 და რვა სტიმული; ჭრის სისქე იყო 2 მმ, უფსკრული 0,2 მმ.
მას შემდეგ, რაც ბოლო ფოტო გადაიღეს და ბოლო კურდღელი მოკლეს, მოჩვენებითი, კუნთებში ჩასმული და NP დისკები ამოიღეს ჰისტოლოგიური გამოკვლევისთვის. ქსოვილები დაფიქსირდა 10% ნეიტრალურ ბუფერულ ფორმალინში 1 კვირის განმავლობაში, დეკალციფიცირებული იყო ეთილენდიამინტეტრაძმარმჟავით და პარაფინის სექცია. ქსოვილის ბლოკები ჩასმული იყო პარაფინში და დაჭრეს საგიტალურ მონაკვეთებად (5 მკმ სისქის) მიკროტომის გამოყენებით. სექციები შეღებილი იყო ჰემატოქსილინით და ეოზინით (H&E).
თითოეულ ჯგუფში კურდღლებისგან მალთაშუა დისკების შეგროვების შემდეგ, მთლიანი რნმ ამოღებულია UNIQ-10 სვეტის (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., ჩინეთი) მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით და Improm II საპირისპირო ტრანსკრიფციის სისტემის (Promega Inc. , მედისონი, WI, აშშ). შესრულდა საპირისპირო ტრანსკრიფცია.
RT-qPCR შესრულდა Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., აშშ) და SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, აშშ) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის მიხედვით. PCR რეაქციის მოცულობა იყო 20 μl და შეიცავდა 1.5 μl განზავებულ cDNA-ს და 0.2 μM თითოეული პრაიმერის. პრაიმერები შექმნილია OligoPerfect Designer-ის მიერ (Invitrogen, Valencia, CA) და დამზადებულია Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (ჩინეთი) მიერ (ცხრილი 1). გამოყენებული იქნა შემდეგი თერმოციკლური პირობები: საწყისი პოლიმერაზას აქტივაციის საფეხური 94°C-ზე 2 წუთის განმავლობაში, შემდეგ 40 ციკლი 15 წმ-იანი თითოეული 94°C-ზე შაბლონის დენატურაციისთვის, ანეილირება 1 წთ 60°C-ზე, გაფართოება და ფლუორესცენცია. გაზომვები ჩატარდა 1 წუთის განმავლობაში 72°C ტემპერატურაზე. ყველა ნიმუში გაძლიერდა სამჯერ და საშუალო მნიშვნელობა იქნა გამოყენებული RT-qPCR ანალიზისთვის. გაძლიერების მონაცემები გაანალიზდა FlexStation 3-ის გამოყენებით (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). IL-4, IL-17 და IFN-γ გენის ექსპრესია ნორმალიზებული იყო ენდოგენურ კონტროლამდე (ACTB). სამიზნე mRNA-ს ფარდობითი გამოხატვის დონეები გამოითვალა 2-ΔΔCT მეთოდის გამოყენებით.
მთლიანი ცილა ამოღებულ იქნა ქსოვილებიდან ქსოვილის ჰომოგენიზატორის გამოყენებით RIPA ლიზის ბუფერში (რომელიც შეიცავს პროტეაზას და ფოსფატაზას ინჰიბიტორ კოქტეილს) და შემდეგ ცენტრიფუგირებულ იქნა 13000 rpm-ზე 20 წუთის განმავლობაში 4°C-ზე ქსოვილის ნარჩენების მოსაშორებლად. ორმოცდაათი მიკროგრამი ცილა ჩაიტვირთა თითო ხაზში, გამოეყო 10% SDS-PAGE და შემდეგ გადავიდა PVDF მემბრანაში. ბლოკირება განხორციელდა 5% უცხიმო მშრალ რძეში Tris-ბუფერულ ფიზიოლოგიურ ხსნარში (TBS), რომელიც შეიცავდა 0.1% Tween 20-ს 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. მემბრანა ინკუბირებული იყო კურდღლის ანტიდეკორინის პირველადი ანტისხეულით (განზავებული 1:200; ბოსტერი, ვუჰანი, ჩინეთი) (განზავებული 1:200; Bioss, პეკინი, ჩინეთი) ღამით 4°C-ზე და რეაგირებდა მეორე დღეს; მეორადი ანტისხეულით (თხის საწინააღმდეგო კურდღლის იმუნოგლობულინი G 1:40,000 განზავებით) კომბინირებული ცხენის პეროქსიდაზასთან (ბოსტერი, ვუჰანი, ჩინეთი) 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. Western blot სიგნალები გამოვლინდა გაზრდილი ქიმილუმინესცენტით ქიმილუმინესცენტურ მემბრანაზე რენტგენის დასხივების შემდეგ. დენსიტომეტრიული ანალიზისთვის, ბლოტები დაასკანირდა და რაოდენობრივად იქნა განსაზღვრული BandScan პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით და შედეგები გამოიხატა როგორც სამიზნე გენის იმუნორეაქტიულობის თანაფარდობა ტუბულინის იმუნორეაქტიულობასთან.
სტატისტიკური გამოთვლები განხორციელდა SPSS16.0 პროგრამული პაკეტის (SPSS, აშშ) გამოყენებით. კვლევის დროს შეგროვებული მონაცემები გამოხატული იყო საშუალოდ ± სტანდარტული გადახრით (საშუალო ± SD) და გაანალიზებული იყო ცალმხრივი განმეორებითი ზომების ვარიაციის ანალიზის (ANOVA) გამოყენებით ორ ჯგუფს შორის განსხვავებების დასადგენად. P <0.05 ჩაითვალა სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი.
ამრიგად, MC-ს ცხოველური მოდელის დადგენა ხერხემლის სხეულში აუტოლოგიური NP-ების იმპლანტაციის გზით და მაკროანატომიური დაკვირვების, MRI ანალიზის, ჰისტოლოგიური შეფასებისა და მოლეკულური ბიოლოგიური ანალიზის ჩატარებით შეიძლება გახდეს მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტი ადამიანის MC-ის მექანიზმების შესაფასებლად და გასაგებად და ახალი თერაპიული საშუალებების შემუშავებისთვის. ინტერვენციები.
როგორ მოვიყვანოთ ეს სტატია: Han, C. et al. მოდური ცვლილებების ცხოველური მოდელი შეიქმნა აუტოლოგიური ბირთვის პულპოსუსის იმპლანტაციის გზით წელის ხერხემლის სუბქონდრულ ძვალში. მეცნიერ. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. წელის ხერხემლის მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია: დისკის თიაქრის და შეკავების გავრცელება, ნერვის ფესვების შეკუმშვა, ბოლო ფირფიტის ანომალიები და სახსრის სახსრის ოსტეოართრიტი უსიმპტომო მოხალისეებში . განაკვეთი. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, and Leboeuf-Eed, K. Modic ცვლილებები და მათი კავშირი კლინიკურ აღმოჩენებთან. ევროპის ხერხემლის ჟურნალი: ევროპის ხერხემლის საზოგადოების, ხერხემლის დეფორმაციის ევროპული საზოგადოების და საშვილოსნოს ყელის ხერხემლის კვლევის ევროპული საზოგადოების ოფიციალური პუბლიკაცია 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
კუისმა, მ., და სხვ. მოდური ცვლილებები წელის ხერხემლის ბოლო ფირფიტებში: პრევალენტობა და ასოციაცია წელის ტკივილთან და რადიკულიტით საშუალო ასაკის მამაკაცებში. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., and Dalinka, M. ძვლის ტვინის MRI ცვლილებები ბოლო ფირფიტასთან ახლოს წელის ხერხემლის დეგენერაციული დაავადების დროს. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ და Carter, JR დეგენერაციული დისკის დაავადება: ხერხემლის ტვინის ცვლილებების შეფასება MRI-ით. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS და Carter, JR დეგენერაციული დისკის დაავადების გამოსახულება. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
ჯენსენი, TS და სხვ. ზოგად პოპულაციაში ნეოვერტებრული ბოლო ფირფიტის (Modic) სიგნალის ცვლილებების წინასწარმეტყველები. ევროპის ხერხემლის ჟურნალი: ევროპის ხერხემლის საზოგადოების ოფიციალური პუბლიკაცია, ხერხემლის დეფორმაციის ევროპული საზოგადოება და საშვილოსნოს ყელის ხერხემლის კვლევის ევროპული საზოგადოება, განყოფილება 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB and Mannisch, K. Modic ცვლილებები წელის დისკის თიაქრის შემდეგ. ევროპის ხერხემლის ჟურნალი: ევროპის ხერხემლის საზოგადოების ოფიციალური პუბლიკაცია, ხერხემლის დეფორმაციის ევროპული საზოგადოება და საშვილოსნოს ყელის ხერხემლის კვლევის ევროპული საზოგადოება 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., and Kaapa, E. Modic I ტიპის ცვლილებებს შეუძლიათ იწინასწარმეტყველონ სწრაფად პროგრესირებადი დეფორმაციული დისკის დეგენერაცია: 1-წლიანი პერსპექტიული კვლევა. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ და Fan, SW Modic ცვლილებები: შესაძლო მიზეზები და წვლილი წელის დისკის დეგენერაციაში. სამედიცინო ჰიპოთეზები 73, 930-932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV შიდა დისკის რღვევა. დისკის პროლაფსის პრობლემები 50 წელზე მეტი ხნის განმავლობაში. ხერხემალი (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).