ანტი-ბიოფილმის ეფექტი და ვერცხლის ნიტრატის სამკურნალო სამკურნალო სტიმულირება

გმადლობთ Nature.com– ის მონახულებისათვის. ბრაუზერის ვერსიას, რომელსაც თქვენ იყენებთ, აქვს შეზღუდული CSS მხარდაჭერა. საუკეთესო შედეგებისთვის, გირჩევთ გამოიყენოთ თქვენი ბრაუზერის ახალი ვერსია (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer- ში). იმავდროულად, მიმდინარე მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილის ან JavaScript– ის გარეშე.
ჭრილობების მიკრობული ზრდა ხშირად ვლინდება როგორც ბიოფილმები, რომლებიც ხელს უშლის სამკურნალო და ძნელია აღმოფხვრა. ახალი ვერცხლისფერი სამკერვალოები აცხადებენ, რომ ებრძვიან ჭრილობის ინფექციებს, მაგრამ მათი ანტიბიოფილმის ეფექტურობა და ინფექციის დამოუკიდებელი სამკურნალო ეფექტები ზოგადად უცნობია. In vitro და in vivo biofilm მოდელების გამოყენებით Staphylococcus aureus და Pseudomonas aeruginosa, ჩვენ ვაფიქსირებთ AG1+ იონური წარმოქმნის სამკურნალო საშუალებების ეფექტურობას; Ag1+ სამკერვალო, რომელიც შეიცავს ეთილენედიამეტეტეტრატეტულ მჟავას და ბენზეთონიუმის ქლორიდს (AG1+/EDTA/BC) და ვერცხლის ნიტრატის შემცველი სამოსები (Ag oxysalts). , რომლებიც წარმოქმნიან Ag1+, Ag2+ და Ag3+ იონებს ჭრილობის ბიოფილმს ებრძოლონ და მის გავლენას განკურნებასთან დაკავშირებით. AG1+ სამკერვალოებს მინიმალური გავლენა ჰქონდა ჭრილობის ბიოფილმზე in vitro და თაგვებში (C57BL/6J). ამის საპირისპიროდ, ჟანგბადით მიღებული მარილები და AG1+/EDTA/BC სამკერვალოები მნიშვნელოვნად შეამცირეს ბიოფილმებში სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების რაოდენობა ინ ვიტროში და აჩვენა თაგვის ჭრილობის ბიოფილმებში ბაქტერიული და EPS კომპონენტების მნიშვნელოვანი შემცირება. ამ სამკერვალოებმა განსხვავებული გავლენა მოახდინეს ბიოფილმის ინფიცირებული და არა ბიოფილმური ინფიცირებული ჭრილობების შეხორცებაზე, ხოლო ჟანგბადით მარილის სამკერვალო უფრო მეტ სასარგებლო შედეგებს ახდენენ რეეპითელიალიზაციაზე, ჭრილობის ზომაზე და ანთებაზე, საკონტროლო მკურნალობასა და ვერცხლის სხვა სამკერვალოზე. ვერცხლის გასახდელი ფიზიკოქიმიური თვისებები შეიძლება განსხვავებული გავლენა იქონიოს ჭრილობის ბიოფილმასა და შეხორცებაზე, და ეს უნდა განიხილებოდეს ბიოფილმის ინფიცირებული ჭრილობების სამკურნალოდ გასახდელის არჩევისას.
ქრონიკული ჭრილობები განისაზღვრება, როგორც ”ჭრილობები, რომლებიც ვერ ახერხებენ განკურნების ნორმალურ ეტაპზე რეგულარულად და დროულად”. ქრონიკული ჭრილობები ქმნის ფსიქოლოგიურ, სოციალურ და ეკონომიკურ ტვირთს პაციენტებისთვის და ჯანდაცვის სისტემისთვის. NHS– ის წლიური ხარჯები ჭრილობებისა და მასთან დაკავშირებული თანდაყოლილობის სამკურნალოდ, 2017–182 წლებში 8.3 მილიარდი £ შეადგენს. ქრონიკული ჭრილობები ასევე ამჟამად აქტუალური პრობლემაა შეერთებულ შტატებში, მედიკამენტმა შეაფასა ჭრილობების მქონე პაციენტების მკურნალობის წლიური ღირებულება 28.1 - 96,8 მილიარდი აშშ დოლარით.
ინფექცია არის ძირითადი ფაქტორი, რომელიც ხელს უშლის ჭრილობის შეხორცებას. ინფექციები ხშირად ვლინდება როგორც ბიოფილმები, რომლებიც გვხვდება არა-სამკურნალო ქრონიკული ჭრილობების 78% -ში. ბიოფილმები ქმნიან, როდესაც მიკროორგანიზმები შეუქცევად მიმაგრებულია ზედაპირებზე, მაგალითად, ჭრილობის ზედაპირებზე და შეუძლია დაგროვდეს უჯრედული პოლიმერის (EPS) წარმოქმნის თემები. ჭრილობის ბიოფილმი ასოცირდება ანთებითი რეაქციის გაზრდასთან, რაც იწვევს ქსოვილების დაზიანებას, რამაც შეიძლება შეაჩეროს ან თავიდან აიცილოს განკურნება 4. ქსოვილის დაზიანების ზრდა ნაწილობრივ შეიძლება განპირობებული იყოს მატრიქსის მეტალოპროტეინაზების, კოლაგენაზას, ელასტაზას და რეაქტიული ჟანგბადის სახეობების 5 -ის აქტივობის გაზრდით. უფრო მეტიც, ანთებითი უჯრედები და ბიოფილმები თავად არის ჟანგბადის მაღალი მომხმარებლები და, შესაბამისად, შეიძლება გამოიწვიოს ადგილობრივი ქსოვილის ჰიპოქსია, რაც შეაფასებს სასიცოცხლო ჟანგბადის უჯრედებს, რომლებიც საჭიროა ქსოვილების ეფექტური შეკეთებისთვის 6.
სექსუალურ ბიოფილმებს უაღრესად მდგრადია ანტიმიკრობული აგენტების მიმართ, რომლებიც მოითხოვს აგრესიულ სტრატეგიებს ბიოფილების ინფექციების გასაკონტროლებლად, მაგალითად, მექანიკური მკურნალობა, რასაც მოჰყვება ეფექტური ანტიმიკრობული მკურნალობა. იმის გამო, რომ ბიოფილმებს შეუძლიათ სწრაფად რეგენერაცია, ეფექტურმა ანტიმიკრობებმა შეიძლება შეამცირონ ხელახლა ფორმირების რისკი ქირურგიული დებრიდაციის შემდეგ 7.
ვერცხლი სულ უფრო ხშირად გამოიყენება ანტიმიკრობული სამკერვალოებში და ხშირად გამოიყენება როგორც პირველი რიგის მკურნალობა ქრონიკული ინფიცირებული ჭრილობებისთვის. კომერციულად ხელმისაწვდომი ვერცხლის სახვევია, რომელთაგან თითოეული შეიცავს სხვადასხვა ვერცხლის შემადგენლობას, კონცენტრაციას და ბაზის მატრიქსს. ვერცხლის მკლავებში მიღწევებმა განაპირობა ახალი ვერცხლის მკლავების განვითარება. ვერცხლის მეტალური ფორმა (AG0) არის ინერტული; ანტიმიკრობული ეფექტურობის მისაღწევად, მან უნდა დაკარგოს ელექტრონი, რომ ჩამოყალიბდეს იონური ვერცხლი (AG1+). ტრადიციული ვერცხლისფერი სამკერვალო შეიცავს ვერცხლის ნაერთებს ან მეტალის ვერცხლს, რომელიც, როდესაც სითხე ექვემდებარება, იშლება AG1+ იონების შესაქმნელად. ეს AG1+ იონები რეაგირებენ ბაქტერიულ უჯრედთან, ელექტრონებს სტრუქტურული კომპონენტებისგან ან გადარჩენისთვის აუცილებელი კრიტიკული პროცესების ამოღება. დაპატენტებულმა ტექნოლოგიამ განაპირობა ახალი ვერცხლის ნაერთის, Ag oxysalts (ვერცხლის ნიტრატი, AG7NO11) განვითარება, რომელიც შედის ჭრილობის სამკერვალოში. ტრადიციული ვერცხლისგან განსხვავებით, ჟანგბადის შემცველი მარილების დაშლა წარმოქმნის ვერცხლის მდგომარეობებს უფრო მაღალი ვალენტით (AG1+, AG2+და AG3+). ინ ვიტრო კვლევებმა აჩვენა, რომ ჟანგბადიანი ვერცხლის მარილების დაბალი კონცენტრაცია უფრო ეფექტურია, ვიდრე ერთი იონური ვერცხლი (AG1+) პათოგენური ბაქტერიების საწინააღმდეგოდ, როგორიცაა Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus და Escherichia coli8,9. ვერცხლის გასახდელი კიდევ ერთი ახალი ტიპი მოიცავს დამატებით ინგრედიენტებს, კერძოდ, ეთილენდამინეტეტრააცეტულ მჟავას (EDTA) და ბენზეთონიუმის ქლორიდს (BC), რომლებიც იტყობინება სამიზნე ბიოფილმ EPS და ამით ზრდის ვერცხლის შეღწევას ბიოფილმში. ეს ახალი ვერცხლის ტექნოლოგიები გთავაზობთ ახალ გზებს ჭრილობის ბიოფილმების მიზნებისთვის. ამასთან, ამ ანტიმიკრობების გავლენა ჭრილობის გარემოზე და ინფექციით დამოუკიდებელი განკურნებაზე მნიშვნელოვანია იმისთვის, რომ ისინი არ შექმნან ჭრილობის არასახარბიელო გარემო ან შეხებით. ინ ვიტრო ვერცხლის ციტოტოქსიურობის შესახებ შეშფოთება დაფიქსირდა რამდენიმე ვერცხლისფერი სამოსით 10,11. ამასთან, ინ ვიტრო ციტოტოქსიურობა ჯერ არ არის ნათარგმნი in vivo ტოქსიკურობაში, და AG1+ რამდენიმე სამკერვალო აჩვენა უსაფრთხოების კარგი პროფილი .12.
აქ, ჩვენ გამოვიკვლიეთ კარბოქსიმეთილცელულოზის სამკერვალოების ეფექტურობა, რომელიც შეიცავს ვერცხლის ვერცხლის ფორმულირებებს ჭრილობის ბიოფილმის წინააღმდეგ in vitro და in vivo. გარდა ამისა, შეფასდა ამ სამკერვალოების შედეგები იმუნურ პასუხებზე და ინფექციისგან დამოუკიდებელი განკურნება.
გამოყენებული ყველა სამოსელი კომერციულად ხელმისაწვდომი იყო. 3M Kerracel გელის ბოჭკოვანი გასახდელი (3M, Knutsford, დიდი ბრიტანეთი) არის არა-ანტისიკრობული 100% კარბოქსიმეთილცელულოზის (CMC) გელის ბოჭკოვანი გასახდელი, რომელიც გამოიყენებოდა როგორც საკონტროლო გასახდელი ამ კვლევაში. შეფასდა სამი ანტიმიკრობული CMC ვერცხლისფერი სამკერვალო, კერძოდ, 3M Kerracel AG გასახდელი (3M, Knutsford, UK), რომელიც შეიცავს 1.7 ვტ%-ს. ჟანგბადიანი ვერცხლის მარილი (AG7NO11) უფრო მაღალი ვალენტურობის ვერცხლის იონებში (AG1+, AG2+და AG3+). Ag7No11, Ag1+, Ag2+ და Ag3+ იონების დაშლის დროს წარმოიქმნება თანაფარდობა 1: 2: 4. Aquacel Ag დამატებითი გასახდელი, რომელიც შეიცავს 1.2% ვერცხლის ქლორიდს (AG1+) (Convatec, Deeside, UK) 13 და Aquacel AG+დამატებითი გასახდელი, რომელიც შეიცავს 1.2% ვერცხლის ქლორიდს (AG1+), EDTA და ბენზეთონიუმის ქლორიდს (Convatec, Deeside, UK) 14.
ამ კვლევაში გამოყენებული შტამები იყო Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (საზოგადოებრივი ჯანმრთელობის ინგლისი, სალისბერი) და Staphylococcus aureus NCTC 6571 (საზოგადოებრივი ჯანმრთელობის ინგლისი, სალისბერი).
ბაქტერიები გაიზარდა ღამით მიულერ-ჰინტონის ბულიონში (ოქსიდი, ალტრინჩამი, დიდი ბრიტანეთი). ღამის კულტურა შემდეგ განზავდა 1: 100 მუელერ-ჰინტონის ბულიონში და 200 μL მოოქროვილი სტერილურ 0.2 μm Whatman Cyclopore Membranes (Whatman PLC, Maidstone, დიდი ბრიტანეთი) Mueller-Hinton Agar Plates- ზე (Sigma-Aldrich Company LTD, კენტ, დიდი ბრიტანეთი ). ) კოლონიური ბიოფილმის წარმოქმნა 37 ° C ტემპერატურაზე 24 საათის განმავლობაში. ეს კოლონიური ბიოფილმები შემოწმდა ლოგარითმული შემცირებისთვის.
გასახდელი გაჭერით 3 სმ 2 კვადრატულ ნაჭრებად და სტერილური დეიონიზირებული წყლით წინასწარ-ჩისტენი. მოათავსეთ ბანდაჟი კოლონიის ბიოფილმზე აგარის ფირფიტაზე. ყოველ 24 ჰა ბიოფილმი ამოიღეს, ხოლო ბიოფილმის შიგნით სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიები (CFU/mL) რაოდენობრივი იქნა სერიული განზავებით (10−1-დან 10−7) დღის კუთხის ნეიტრალიზაციის ბულიონში (Merck-Millipore). 24 საათის განმავლობაში ინკუბაციის შემდეგ 37 ° C- ზე, სტანდარტული ფირფიტის რაოდენობა ჩატარდა Mueller-Hinton Agar ფირფიტებზე. თითოეული მკურნალობა და დროის წერტილი ჩატარდა სამჯერ, ხოლო ფირფიტის რაოდენობა განმეორდა თითოეული განზავებისთვის.
ღორის მუცლის კანი მიიღება ქალის დიდი თეთრი ღორისგან, ხოცვის 15 წუთში, ევროკავშირის ექსპორტის სტანდარტების შესაბამისად. კანი გაპარსული და გაწმენდილი იყო ალკოჰოლის ტილოებით, შემდეგ კი გაყინული -80 ° C ტემპერატურაზე 24 საათის განმავლობაში, კანის გადახრაზე. დათბობის შემდეგ, 1 სმ 2 კანის ნაჭრები სამჯერ დაიბანეთ PBS, 0.6% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტი და 70% ეთანოლი 20 წუთის განმავლობაში. ეპიდერმისის ამოღებამდე, ამოიღეთ დარჩენილი ეთანოლი 3 -ჯერ სტერილურ PBS- ში. კანი კულტივირებული იყო 6 ჭაბურღილის ფირფიტაში, 0.45-μm სისქის ნეილონის მემბრანით (მერკ-მილიპორი) ზედა და 3 შთამნთქმელი ბალიშები (მერკ-მილიპორი), რომელიც შეიცავს 3 მლ ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი შრატს (სიგმა), რომელიც შეავსეს 10% Dulbecco- ს მოდიფიცირებულ 10% არწივი. საშუალო (Dulbecco- ს შეცვლილი არწივის საშუალო - შპს ოლდრიხი).
კოლონიური ბიოფილმები გაიზარდა, როგორც ეს აღწერილია ბიოფილმის ზემოქმედების კვლევებისთვის. 72 საათის განმავლობაში მემბრანაზე ბიოფილმის კულტივირების შემდეგ, ბიოფილმი გამოიყენეს კანის ზედაპირზე სტერილური ინოკულაციის მარყუჟის გამოყენებით და მემბრანა ამოიღეს. ბიოფილმი შემდეგ ღორის დერმატზე ინკუბაცია მიიღეს დამატებით 24 საათის განმავლობაში 37 ° C ტემპერატურაზე, რათა ბიოფილმი მომწიფდეს და დაიცვან ღორის კანი. მას შემდეგ, რაც ბიოფილმი მომწიფდა და მიმაგრებული იყო, 1.5 სმ 2-ის გასახდელი, რომელიც წინასწარ იყო ჩაფლული სტერილური გამოხდილი წყლით, გამოიყენეს პირდაპირ კანის ზედაპირზე და ინკუბაცია მიიღეს 37 ° C ტემპერატურაზე 24 საათის განმავლობაში. სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების ვიზუალიზაცია მოხდა prestoblue უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის რეაგენტის (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, დიდი ბრიტანეთის) ერთნაირად გამოყენებით თითოეული ასახვის ზედაპირზე და 5 წუთის განმავლობაში ინკუბაცია. გამოიყენეთ Leica DFC425 ციფრული კამერა, რომ დაუყოვნებლივ გადაიღოთ სურათები Leica MZ8 მიკროსკოპზე. ტერიტორიები ფერადი ვარდისფერი რაოდენობრივი იყო გამოსახულების Pro პროგრამული უზრუნველყოფის 10 ვერსიის გამოყენებით (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). ელექტრონული მიკროსკოპის სკანირება ჩატარდა, როგორც ეს აღწერილია ქვემოთ.
ღამით გაიზარდა ბაქტერიები განზავებული 1: 100 მუელერ-ჰინტონის ბულიონში. 200 μL კულტურა დაემატა სტერილურ 0.2 μM Whatman Cyclopore Membrane (Whatman, Maidstone, UK) და მოოქროვილი იყო Mueller-Hinton Agar- ზე. ბიოფილმის ფირფიტები ინკუბაცია მიიღეს 37 ° C ტემპერატურაზე 72 საათის განმავლობაში, რათა მოხდეს ბიოფილმის სექსუალურ წარმოქმნა.
ბიოფილმის მომწიფების 3 დღის შემდეგ, 3 სმ 2 კვადრატული ბაფთით მოათავსეს პირდაპირ ბიოფილმზე და ინკუბაცია მიიღეს 37 ° C ტემპერატურაზე 24 საათის განმავლობაში. ბიოფილმის ზედაპირიდან ბაფთების ამოღების შემდეგ, PrestoBlue უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის რეაგენტი 1 მლ (Invitrogen, Waltham, MA) დაემატა თითოეული ბიოფილმის ზედაპირს 20 წამის განმავლობაში. ზედაპირები გაშრეს, სანამ ფერადი ცვლილებები დაფიქსირდებოდა Nikon D2300 ციფრული კამერის გამოყენებით (შპს Nikon UK, Kingston, UK).
მოამზადეთ ღამის კულტურები მუელერ-ჰინტონ აგარზე, გადაიტანეთ ინდივიდუალური კოლონიები 10 მლ მიელერ-ჰინტონის ბულიონში და შეიკრიბეთ შეიკერზე 37 ° C ტემპერატურაზე (100 rpm). ღამის ინკუბაციის შემდეგ, კულტურა განზავდა 1: 100 მუელერ-ჰინტონის ბულიონში და 300 μL დაფიქსირდა 0.2 μm წრიულ Whatman Cyclopore მემბრანზე (Whatman International, Maidstone, UK) Mueller-Hinton Agar- ზე და ინკუბაცია მოახდინა 37 ° C- ზე 72 საათში . . სექსუალურ ბიოფილმი გამოიყენეს ჭრილობას, როგორც ეს აღწერილია ქვემოთ.
ცხოველებთან ყველა მუშაობა განხორციელდა მანჩესტერის უნივერსიტეტში, ცხოველთა კეთილდღეობისა და ეთიკური მიმოხილვის ოფისის მიერ დამტკიცებული პროექტის ლიცენზიით (P8721BD27) და საშინაო ოფისის მიერ გამოქვეყნებული სახელმძღვანელო მითითებების შესაბამისად, 2012 წლის შესწორებული ASPA– ს მიერ. ყველა ავტორს დაიცვა ჩამოსვლის სახელმძღვანელო პრინციპები. რვა კვირიანი C57BL/6J თაგვები (Envigo, Oxon, დიდი ბრიტანეთი) გამოყენებულ იქნა ყველა in vivo კვლევისთვის. თაგვები ანესთეზირებულ იქნა იზოფლურანთან (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, დიდი ბრიტანეთი) და მათი დორსალური ზედაპირები გაპარსული და გაწმენდილი იყო. შემდეგ თითოეულ თაგვს მიენიჭა 2 × 6 მმ ექსკაციონალური ჭრილობა Stiefel BioPsy Punch- ის გამოყენებით (Schuco International, Hertfordshire, დიდი ბრიტანეთი). ბიოფილმით ინფიცირებული ჭრილობებისთვის, წაისვით 72-საათიანი კოლონიური ბიოფილმი, რომელიც გაიზარდა მემბრანაზე, როგორც ზემოთ აღწერილი ჭრილობის დერმატულ ფენაზე, სტერილური ინოკულაციის მარყუჟის გამოყენებით, დაზიანებისთანავე და მემბრანა გადააადგილეთ. გასახდელის ერთი კვადრატული სანტიმეტრი წინასწარ არის ჩაფლული სტერილური წყლით, ტენიანი ჭრილობის გარემოს შესანარჩუნებლად. სამკერვალოები უშუალოდ იქნა გამოყენებული თითოეულ ჭრილზე და დაფარული იყო 3M Tegaderm Film (3M, Bracknell, UK) და Mastisol თხევადი წებოვანი (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI), რომლებიც გამოყენებულ იქნა კიდეების გარშემო, რათა უზრუნველყოს დამატებითი ადჰეზი. ბუპრენორფინი (Animalcare, York, UK) დაინიშნა 0,1 მგ/კგ კონცენტრაციით, როგორც ანალგეტიკური. Cull თაგვები ტრავმის შემდეგ სამი დღის შემდეგ, გრაფიკის 1 მეთოდის გამოყენებით და საჭიროებისამებრ ჭრილობის ფართობის ამოღება, განაჩენი და შეინახეთ ჭრილობის ადგილი.
ჰემატოქსილინის (თერმოფიზერის სამეცნიერო) და ეოზინის (თერმოფიზერის სამეცნიერო) შეღებვა ჩატარდა მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად. ჭრილობის არეალი და რეპერტუარიზაცია რაოდენობრივი იქნა გამოსახულების Pro პროგრამული უზრუნველყოფის 10 ვერსიის გამოყენებით (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
ქსოვილის სექციები დაინერგა Xylene (Thermofisher Scientific, Loughborough, დიდი ბრიტანეთი), რეჰიდრატირებული იქნა 100-50% ფასდაკლებით ეთანოლით და მოკლედ ჩაეფლო დიონიზებულ წყალში (Thermofisher Scientific). იმუნოჰისტოქიმია ჩატარდა Vectastain Elite ABC PK-6104 ნაკრები (ვექტორული ლაბორატორიები, ბურლინგამი, კალიფორნია) მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად. ნეიტროფილების პირველადი ანტისხეულები NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) და მაკროფაგები MS CD107B სუფთა M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK, დიდი ბრიტანეთი) განზავებული იქნა 1: 100 ბლოკირების ხსნარში და დაემატა მოჭრილი ზედაპირი, შემდეგ მოჰყვა 2 ანტისხეულების საწინააღმდეგო ანტისხეულებს ანტი-ვექტორტიტინი ABC და ვექტორული ნოვა წითელი პეროქსიდაზა (HRP) სუბსტრატის ნაკრები (ვექტორული ლაბორატორიები, ბურლინგამი, კალიფორნია) და ჰემატოქსილინით გამოირჩევა. სურათები შეიძინა Olympus BX43 მიკროსკოპის და Olympus DP73 ციფრული კამერის გამოყენებით (Olympus, Southend-on-Sea, დიდი ბრიტანეთი).
კანის ნიმუშები დაფიქსირდა 2.5% გლუტარალდეჰიდში და 4% ფორმალდეჰიდში 0,1 მ ჰეპში (pH 7.4) 24 საათის განმავლობაში 4 ° C ტემპერატურაზე. ნიმუშები დეჰიდრატირებულ იქნა ფასდაკლებული ეთანოლის გამოყენებით და გამხმარი CO2- ში, Quorum K850 კრიტიკული წერტილის საშრობი (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK, დიდი ბრიტანეთი) და ოქროს პალადიუმის შენადნობით დაფარული sputter გამოყენებით Quorum SC7620 მინი sputterer/glow გამონადენი სისტემის გამოყენებით. ნიმუშები იქნა გამოსახული FEI Quanta 250 სკანირების ელექტრონული მიკროსკოპის გამოყენებით (Thermofisher Scientific) ჭრილობის ცენტრალური წერტილის ვიზუალიზაციისთვის.
ტოტო -1 იოდიდი (2 μM) იქნა გამოყენებული თაგვის ჭრილობის ამოღებულ ზედაპირზე და ინკუბაცია მიიღეს 5 წუთის განმავლობაში 37 ° C ტემპერატურაზე (Thermofisher Scientific) და მკურნალობდნენ SYTO-60- ით (10 μM) 37 ° C ტემპერატურაზე (Thermofisher Scientific). 15 წუთიანი Z-stack სურათები შეიქმნა Leica TCS SP8– ის გამოყენებით.
ბიოლოგიური და ტექნიკური რეპლიკაციის მონაცემები დაფიქსირდა და გაანალიზდა GraphPad Prism V9 პროგრამის გამოყენებით (GraphPad Software, La Jolla, CA). მრავალჯერადი შედარების ცალმხრივი ანალიზი მრავალჯერადი შედარებით, Dunnett– ის შემდგომი ტესტის გამოყენებით იქნა გამოყენებული თითოეულ მკურნალობასა და არა-ანტიიმიკრობული კონტროლის გასახდელი განსხვავებების შესამოწმებლად. P მნიშვნელობა <0.05 მნიშვნელოვანად იქნა მიჩნეული.
ვერცხლის გელის ბოჭკოვანი სამკერვალოების ეფექტურობა პირველად შეფასდა Staphylococcus aureus- ისა და Pseudomonas aeruginosa- ს ბიოფილმური კოლონიების წინააღმდეგ ინ ვიტროში. ვერცხლისფერი სამკერვალოები შეიცავს ვერცხლის სხვადასხვა ფორმულებს: ტრადიციული ვერცხლისფერი სამკერვალო აწარმოებს Ag1+ იონებს; ვერცხლისფერი სამკერვალო, რომელსაც შეუძლია AG1+ იონები წარმოქმნას EDTA/BC დამატების შემდეგ, შეიძლება გაანადგუროს ბიოფილმის მატრიცა და ვერცხლისფერი ბაქტერიები ვერცხლის ანტიბაქტერიული ეფექტის ქვეშ გამოამჟღავნოს ვერცხლის ანტიბაქტერიული ეფექტის ქვეშ. იონები 15 და სამოსები, რომლებიც შეიცავს ჟანგბადის მარილებს, რომლებიც წარმოქმნიან Ag1+, Ag2+ და Ag3+ იონებს. მისი ეფექტურობა შედარებულია გელით ბოჭკოებისგან დამზადებულ არაადიმიკრობული კონტროლის გასახდელთან. ბიოფილმის შიგნით დარჩენილი სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიები შეფასდა ყოველ 24 საათში 8 დღის განმავლობაში (სურათი 1). მე –5 დღეს, ბიოფილმი ხელახლა მოხდა 3.85 × 105 წლით. Staphylococcus aureus ან 1.22 × 105p. Aeruginosa ბიოფილმის აღდგენის შესაფასებლად. არა ანტიმიკრობული კონტროლის სამკურნალო საშუალებებთან შედარებით, AG1+ სამკერვალოებმა მინიმალური გავლენა მოახდინეს ბაქტერიულ სიცოცხლისუნარიანობაზე Staphylococcus aureus- ში და Pseudomonas aeruginosa- ს ბიოფილმებში 5 დღის განმავლობაში. ამის საპირისპიროდ, ჟანგბადის Ag და Ag1 + + EDTA/BC მარილების შემცველი სამკერვალო ეფექტური იყო ბიოფილმის ბაქტერიების მკვლელობაში 5 დღის განმავლობაში. პლანქტონური ბაქტერიებით განმეორებითი ინოკულაციის შემდეგ, მე -5 დღეს, ბიოფილმის აღდგენა არ დაფიქსირებულა (ნახ. 1).
სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების რაოდენობრივი მაჩვენებელი Staphylococcus aureus და Pseudomonas aeruginosa biofilms– ში ვერცხლის სამკერვალო მკურნალობის შემდეგ. Staphylococcus aureus- ისა და Pseudomonas aeruginosa- ს ბიოფილმური კოლონიები მკურნალობდნენ ვერცხლის გასახდელებით ან ანტიტიმიკრობული კონტროლის სამკურნალო საშუალებებით, ხოლო დარჩენილი სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების რაოდენობა განისაზღვრა ყოველ 24 საათში. 5 დღის შემდეგ, ბიოფილმი რეინოკულირებულია 3.85 × 105 -ით. Staphylococcus aureus ან 1.22 × 105p. ბიოფილმის აღდგენის შესაფასებლად ინდივიდუალურად შეიქმნა ბაქტერიოპლანქტონის Pseudomonas aeruginosa- ს კოლონიები. გრაფიკებში ნაჩვენებია საშუალო +/- სტანდარტული შეცდომა.
ვერცხლისფერი სამკერვალოების ეფექტის ვიზუალიზაციისთვის ბიოფილმის სიცოცხლისუნარიანობაზე, სამკერვალოები გამოიყენეს ღორის კანზე EX vivo- ზე გაზრდილ სექსუალურ ბიოფილმებზე. 24 საათის შემდეგ, გასახდელი ამოღებულია და ბიოფილმი შეღებილია ლურჯი რეაქტიული საღებავით, რომელიც მეტაბოლიზდება ცოცხალი ბაქტერიებით ვარდისფერ ფერამდე. საკონტროლო სამკერვალოებით დამუშავებული ბიოფილმები ვარდისფერი იყო, რაც მიუთითებს ბიოფილმში სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების არსებობაზე (სურათი 2 ა). ამის საპირისპიროდ, Ag oxysols– ის გასახდელთან დამუშავებული ბიოფილმი, პირველ რიგში, ლურჯი იყო, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ღორის კანის ზედაპირზე დარჩენილი ბაქტერიები არაკეთილსინდისიერი ბაქტერიები იყო (სურათი 2B). შერეული ლურჯი და ვარდისფერი შეღებვა დაფიქსირდა Biofilms– ში, რომლებიც მკურნალობდნენ AG1+-შემცველი სამკერვალოებით, რაც მიუთითებს ბიოფილმის შიგნით სიცოცხლისუნარიანი და არა სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების არსებობაზე (სურათი 2C), ხოლო EDTA/BC გასახდელი, რომელიც შეიცავს AG1+-ს, ძირითადად ლურჯი ვარდისფერი ლაქებით. ვერცხლის გასახდელი დაზარალებული ადგილების მითითებით (სურათი 2D). აქტიური (ვარდისფერი) და არააქტიური (ლურჯი) ტერიტორიების რაოდენობამ აჩვენა, რომ საკონტროლო პაჩი 75% აქტიური იყო (სურათი 2E). AG1 + + EDTA/BC სამკერვალოები ასრულებდნენ ანალოგიურად ჟანგბადის მარილის სამოსს, გადარჩენის მაჩვენებლები 13% და 14%, შესაბამისად. AG1+ ჩაცმულობამ ასევე შეამცირა ბაქტერიული სიცოცხლისუნარიანობა 21%-ით. ეს ბიოფილმები შემდეგ დაფიქსირდა ელექტრონული მიკროსკოპის სკანირების გამოყენებით (SEM). საკონტროლო გასახდელი და AG1+ გასახდელი მკურნალობის შემდეგ, Pseudomonas aeruginosa- ს ფენა დაფიქსირდა ღორის ღორის კანის დაფარვაში (სურათი 2F, H), ხოლო AG1+ გასახდელთან მკურნალობის შემდეგ, ნაპოვნი იქნა რამდენიმე ბაქტერიული უჯრედი და ნაპოვნი იქნა ბაქტერიული უჯრედები. კოლაგენის ბოჭკოები შეიძლება ჩაითვალოს ღორის კანის ქსოვილის სტრუქტურად (სურათი 2G). AG1 + + EDTA/BC გასახდელი მკურნალობის შემდეგ, ბაქტერიული დაფები და კოლაგენის ბოჭკოვანი დაფები ხილული იყო (სურათი 2I).
Pseudomonas aeruginosa biofilm- ის ვიზუალიზაცია ვერცხლის გასახდელი მკურნალობის შემდეგ. (A-D) ბაქტერიული სიცოცხლისუნარიანობა Pseudomonas aeruginosa– ს ბიოფილმებში, რომლებიც გაიზარდა ღორის კანზე, ვიზუალიზებულია Prestoblue– ის სიცოცხლისუნარიანობის საღებავის გამოყენებით 24 საათის შემდეგ, ვერცხლისფერი სამკერვალოებით ან ანტიტიმიკრობული კონტროლის სამკურნალო საშუალებებით. ცოცხალი ბაქტერიები ვარდისფერი, არა სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიები და ღორის კანი ლურჯია. (ე) Pseudomonas aeruginosa biofilms– ის რაოდენობრივი რაოდენობა, რომელიც გაიზარდა ღორის კანზე (ვარდისფერი ლაქა), ელექტრონული მიკროსკოპის სკანირების გამოყენებით, Pro Version 10 (FI) და მკურნალობს ვერცხლის გასახდელი ან არა ანტიკრობული კონტროლის გასახდელი 24 საათის განმავლობაში. SEM მასშტაბის ბარი = 5 μm. (J - M) კოლონიური ბიოფილმები გაიზარდა ფილტრებზე და შეღებეს PrestoBlue რეაქტიული საღებავით 24 საათის განმავლობაში ინკუბაციის შემდეგ ვერცხლისფერი სამკერვალო.
იმის დასადგენად, რამდენად გავლენას ახდენენ საკვებსა და ბიოფილმებს შორის მჭიდრო კონტაქტი, ბინა ზედაპირზე მოთავსებულ კოლონიურ ბიოფილმებზე, 24 საათის განმავლობაში მკურნალობდნენ სამკერვალოებით და შემდეგ შეღებეს რეაქტიული საღებავებით. არანამკურნალევი ბიოფილმი იყო მუქი ვარდისფერი ფერი (სურათი 2J). განსხვავებით ბიოფილმებისგან, რომლებიც მკურნალობდნენ ჟანგბადით მიღებული მარილების შემცველი სამკერვალოებით (სურათი 2K), ბიოფილმები, რომლებიც მკურნალობდნენ AG1+ ან AG1+++ EDTA/BC- ს, რომელიც შეიცავს ვარდისფერ შეღებვის ზოლებს (სურათი 2L, M). ეს ვარდისფერი შეღებვა მიუთითებს სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების არსებობაზე და ასოცირდება გასახდელში ნაკერების არეალთან. ეს შეკერილი ადგილები ქმნიან მკვდარ ადგილებს, რომლებიც ბიოფილმის შიგნით ბაქტერიების გადარჩენას საშუალებას აძლევს.
Vivo- ში ვერცხლისფერი სამკერვალოების ეფექტურობის შესაფასებლად, სრულად სისქის ამოღებულმა ჭრილობებმა მოზრდილი ჭრილობები, რომლებიც ინფიცირებულნი არიან სექსუალურ S. aureus და P. aeruginosa biofilms, მკურნალობდნენ არაანთიმიკრობული საკონტროლო სამკერვალოებით ან ვერცხლისფერი სამოსით. მკურნალობის 3 დღის შემდეგ, მაკროსკოპული გამოსახულების ანალიზმა აჩვენა ჭრილობის უფრო მცირე ზომები, როდესაც მკურნალობდნენ ჟანგბადით მარილის სამკერვალოზე, ვიდრე ანტიტიმიკრობული საკონტროლო სამკერვალო და სხვა ვერცხლისფერი სამკერვალო (სურათი 3A-H). ამ დაკვირვებების დასადასტურებლად, ჭრილობები იქნა მიღებული და ჭრილობის არეალი და რეპერტუარიზაცია რაოდენობრივი იქნა ჰემატოქსილინისა და ეოზინისგან შეღებილი ქსოვილების სექციებზე გამოსახულების Pro პროგრამული უზრუნველყოფის 10 ვერსიის გამოყენებით (სურათი 3I-L).
ჭრილობის ზედაპირზე ვერცხლის გასახდელი მოქმედება და ბიოფილმებით ინფიცირებული ჭრილობების ხელახალი ეპითელიალიზაცია. (A–H) Small cells infected with biofilms of Pseudomonas aeruginosa (A–D) and Staphylococcus aureus (E–H) after three days of treatment with a nonantimicrobial control dressing, an oxygenated Ag salt dressing, an Ag1+ dressing, and an Ag1+ გასახდელი. წარმომადგენლობითი მაკროსკოპული სურათები. თაგვების ჭრილობები AG1 + + + EDTA/BC გასახდელი. (IL) წარმომადგენელი Pseudomonas aeruginosa ინფექცია, ჰისტოლოგიური სექციები, რომლებიც შედგენილია ჰემატოქსილინით და ეოზინით, გამოიყენება ჭრილობის არეალის და ეპითელური რეგენერაციის გასაზომად. ჭრილობის ფართობის (M, O) და პროცენტული რეეპითელიალიზაციის (N, P) ჭრილობების რაოდენობრივი რაოდენობა, რომლებიც ინფიცირებულია ფსევდომონას აერუგინოზით (M, N) და Staphylococcus aureus (O, P) ბიოფილმებით (თითო სამკურნალო ჯგუფი N = 12). გრაფიკებში ნაჩვენებია საშუალო +/- სტანდარტული შეცდომა. * ნიშნავს p = <0.05 ** ნიშნავს p = <0.01; მაკროსკოპული მასშტაბი = 2.5 მმ, ჰისტოლოგიური მასშტაბი = 500 μm.
Quantification of wound area in wounds infected with Pseudomonas aeruginosa biofilm (Figure 3M) showed that wounds treated with Ag oxysalts had an average wound size of 2.5 mm2, while the non-antimicrobial control dressing had an average wound size of 3.1 mm2 , which is not მართალია. მიაღწია სტატისტიკურ მნიშვნელობას (სურათი 3 მ). გვ = 0.423). AG1+ ან AG1++ EDTA/BC- ით მკურნალობის ჭრილობებმა არ აჩვენა ჭრილობის ფართობის შემცირება (შესაბამისად, 3.1 მმ 2 და 3.6 მმ 2). ჟანგბადით მიღებული მარილის ჩაცმის მკურნალობა ხელს უწყობს ხელახალი ეპითელიალიზაციას უფრო დიდი ზომით, ვიდრე არა-ანტისიკრობული კონტროლის გასახდელი (34% და 15%, შესაბამისად; P = 0.029) და AG1+ ან AG1++ EDTA/BC (10% და 11%) (10% და 11%) (10% და 11%) (10% და 11%) სურათი 3N). . , შესაბამისად).
ჭრილობის არეალში და ეპითელური რეგენერაციის მსგავსი ტენდენციები დაფიქსირდა S. aureus- ის ბიოფილმებით ინფიცირებულ ჭრილობებში (სურათი 3O). ჟანგბადის ვერცხლის მარილების შემცველი სამკერვალოები შეამცირეს ჭრილობის არეალი (2.0 მმ 2) 23% -ით, საკონტროლო არა-ანტიიმიკრობული გასახდელი (2.6 მმ 2) შედარებით, თუმცა ეს შემცირება არ იყო მნიშვნელოვანი (p = 0.304) (ნახ .3o). გარდა ამისა, AG1+ სამკურნალო ჯგუფში ჭრილობის არეალი ოდნავ შემცირდა (2.4 მმ 2), ხოლო AG1++ EDTA/BC- ით მკურნალობა ჭრილობამ არ შეამცირა ჭრილობის არეალი (2.9 მმ 2). Ag- ის ჟანგბადის მარილებმა ასევე ხელი შეუწყო S. aureus biofilm- ით (31%) ინფიცირებული ჭრილობების ხელახალი ეპითელიალიზაციას უფრო დიდ ზომამდე, ვიდრე მათ, ვისაც მკურნალობდნენ არა ანტიტიმიკრობული საკონტროლო სამკერვალო (12%, p = 0.003) (სურათი 3P). AG1+ ჩაცმა (16%, P = 0.903) და AG+ 1+ EDTA/BC გასახდელი (14%, P = 0.965) აჩვენა ეპითელური რეგენერაციის დონე კონტროლის მსგავსი.
ვერცხლისფერი სამკერვალოების ეფექტის ვიზუალიზაციისთვის, ბიოფილმის მატრიქსზე, ტოტო 1 და SYTO 60 იოდიდის შეღებვა ჩატარდა (ნახ. 4). ტოტო 1 იოდიდი არის უჯრედული დაუფარავი საღებავი, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედული ნუკლეინის მჟავების ზუსტად ვიზუალიზაციისთვის, რომლებიც უხვად არის ბიოფილმების EPS- ში. SYTO 60 არის უჯრედის გამტარი საღებავი, რომელიც გამოიყენება როგორც Counterstain16. ტოტო 1 და SYTO 60 იოდიდის დაკვირვებებმა ფსევდომონას აერუგინოზას ბიოფილმებით ინოკულაციურ ჭრილობებში (სურათი 4A-D) და Staphylococcus aureus (სურათი 4I-L) აჩვენა, რომ 3 დღის გასახდელი მკურნალობის შემდეგ, ბიოფილმში EPS მნიშვნელოვნად შემცირდა. შეიცავს ჟანგბადის მარილებს AG და AG1 + + EDTA/BC. AG1+ სამკერვალო დამატებითი ანტიბიოფილმის კომპონენტების გარეშე მნიშვნელოვნად შეამცირა უჯრედული თავისუფალი დნმ ჭრილობებში ფსევდომონას აერუგინოზასთან ინოკულაციურ ჭრილობებში, მაგრამ ნაკლებად ეფექტური იყო ჭრილობების ჭრილობებში, რომლებიც ინოკულაციას ახდენენ Staphylococcus aureus– ით.
ჭრილობის ბიოფილმის in vivo ვიზუალიზაცია 3 დღის შემდეგ მკურნალობის შემდეგ, საკონტროლო ან ვერცხლისფერი სამკერვალო. Pseudomonas aeruginosa (A -D) და Staphylococcus aureus (I - L) კონფოკალური გამოსახულებები, რომლებიც შეღებილია ტოტო 1 -ით (მწვანე), უჯრედული ნუკლეინის მჟავების ვიზუალიზაციისთვის, უჯრედული ბიოფილმური პოლიმერების კომპონენტი. უჯრედშიდა ნუკლეინის მჟავების შესანარჩუნებლად გამოიყენეთ SYTO 60 (წითელი). მჟავები. P. SCANNING ჭრილობების ელექტრონული მიკროსკოპია, რომელიც ინფიცირებულია Pseudomonas aeruginosa (E - H) და Staphylococcus aureus (M - P) ბიოფილმებით, 3 დღის შემდეგ, საკონტროლო და ვერცხლისფერი სამკერვალო. SEM მასშტაბის ბარი = 5 μm. კონფოკალური ვიზუალიზაციის მასშტაბის ბარი = 50 μm.
ელექტრონული მიკროსკოპის სკანირებამ აჩვენა, რომ ფსევდომონას აერუგინოზას ბიოფილმური კოლონიებით ინოკულაციაა (სურათი 4E-H) და სტაფილოკოკის აურუსს (სურათი 4M-P) მნიშვნელოვნად ნაკლები ბაქტერიები ჰქონდათ ჭრილობებში, ყველა ვერცხლის ჩაცმულობით მკურნალობის 3 დღის შემდეგ.
ბიოფილმით ინფიცირებულ თაგვებში ჭრილობის ანთების შესახებ ვერცხლისფერი სამკერვალოების ეფექტის შესაფასებლად, 3 დღის განმავლობაში კონტროლირებადი ან ვერცხლისფერი სამკერვალოებით მკურნალობის ბიოფილმური ინფიცირებული ჭრილობების მონაკვეთები იმუნოჰისტოქიმიურად იყო შეღებილი ნეიტროფილებისა და მაკროფაგების სპეციფიკური ანტისხეულების გამოყენებით. ნეიტროფილებისა და მაკროფაგების რაოდენობრივი განსაზღვრა შინაგანად. გრანულაციის ქსოვილი. სურათი 5). ვერცხლის ყველა სამკერვალო შეამცირა ნეიტროფილებისა და მაკროფაგების რაოდენობა ფსევდომონას აერუგინოსთან ინფიცირებულ ჭრილობებში, ვიდრე ანტიტიმიკრობული კონტროლის სამკურნალო საშუალებებთან შედარებით, სამდღიანი მკურნალობის შემდეგ. ამასთან, ჟანგბადის ვერცხლის მარილის ჩაცმულთან მკურნალობამ გამოიწვია ნეიტროფილების უფრო დიდი შემცირება (p = <0.0001) და მაკროფაგები (p = <0.0001) შედარებით ვერცხლის სხვა ვერცხლის გასახდელებთან შედარებით (სურათი 5I, J). მიუხედავად იმისა, რომ AG1++ EDTA/BC უფრო მეტ გავლენას ახდენდა ჭრილობის ბიოფილმზე, მან შეამცირა ნეიტროფილების და მაკროფაგების დონე უფრო მცირე ზომით, ვიდრე AG1+ ჩაცმა. S. aureus biofilm- ით ინფიცირებული ზომიერი ჭრილობები ასევე დაფიქსირდა Ag (p = <0.0001), Ag1+ (p = 0.0008) და Ag1 ++ EDTA/BC (p = 0.0043) (p = 0.0043) Oxisols– ით ჩაცმის შემდეგ, საკონტროლო კონტროლთან შედარებით. მსგავსი ტენდენციები შეინიშნება ნეიტროპენია. bandage (ნახ. 5K). ამასთან, მხოლოდ ჟანგბადის მარილის ჩაცმულობამ აჩვენა გრანულაციის ქსოვილში მაკროფაგების რაოდენობის მნიშვნელოვანი შემცირება S. aureus biofilms– ით ინფიცირებულ ჭრილობებში კონტროლთან შედარებით (p = 0.0339) (სურათი 5L).
ნეიტროფილები და მაკროფაგები რაოდენობრივი იქნა Pseudomonas aeruginosa და Staphylococcus aureus biofilms– ით ინფიცირებულ ჭრილობებში, 3 დღის მკურნალობის შემდეგ, არა-ანტიიმიკრობული კონტროლით ან ვერცხლისფერი სამოსით. ნეიტროფილები (AD) და მაკროფაგები (EH) რაოდენობრივი იქნა ნეიტროფილების ან მაკროფაგებისთვის სპეციფიკური ანტისხეულებით შეღებილი ქსოვილების სექციებში. ნეიტროფილების (I და K) და მაკროფაგების (J და L) რაოდენობრივი რაოდენობა ჭრილობებში, რომლებიც ინფიცირებულ იქნა ფსევდომონას აერუგინოზით (I და J) და Staphylococcus aureus (K&L) ბიოფილმებით. N = 12 თითო ჯგუფში. გრაფიკებში ნაჩვენებია საშუალო +/- სტანდარტული შეცდომა, მნიშვნელობის მნიშვნელობები არა-ანტიბაქტერიული კონტროლის გასახდელთან შედარებით, * ნიშნავს p = <0.05, ** ნიშნავს p = <0.01; *** ნიშნავს p = <0.001; მიუთითებს p = <0.0001).
შემდეგ ჩვენ შევაფასეთ ვერცხლის გასახდელი მოქმედება ინფექციის დამოუკიდებელ განკურნებასთან დაკავშირებით. არაინფიცირებული ექსკრეციული ჭრილობები მკურნალობდნენ არა ანტიმიკრობული კონტროლის გასახდელი ან ვერცხლის გასახდელი 3 დღის განმავლობაში (სურათი 6). ტესტირებულ ვერცხლისფერ სამკერვალოებს შორის, მხოლოდ ჟანგბადით მარილის გასახდელი მკურნალობა მხოლოდ ჭრილობები უფრო მცირე იყო მაკროსკოპულ სურათებზე, ვიდრე კონტროლით მკურნალობა ჭრილობები (სურათი 6A-D). ჭრილობის არეალის რაოდენობამ ჰისტოლოგიური ანალიზის გამოყენებით აჩვენა, რომ ჭრილობის საშუალო ფართობი AG ოქსიზოლების გასახდელი მკურნალობის შემდეგ იყო 2.35 მმ 2 შედარებით 2.96 მმ 2 -ით, საკონტროლო ჯგუფთან დამუშავებული ჭრილობებისთვის, მაგრამ ამ განსხვავებამ არ მიაღწია სტატისტიკურ მნიშვნელობას (P = 0.488) (ნახ. 6i). ამის საპირისპიროდ, ჭრილობის არეალის შემცირება არ დაფიქსირებულა AG1+ (3.38 მმ 2, P = 0.757) ან AG1++ EDTA/BC (4.18 მმ 2, P = 0.054) მკურნალობის შემდეგ, საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით. ეპითელური რეგენერაციის გაზრდა დაფიქსირდა Ag oxysol- ის გასახდელთან შედარებით საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (შესაბამისად, 30% წინააღმდეგ 22%, შესაბამისად), თუმცა ამან არ მიაღწია მნიშვნელობას (p = 0.067), ეს საკმაოდ მნიშვნელოვანია და ადასტურებს წინა შედეგებს. ოქსიზოლებით გასახდელი ხელს უწყობს რეევტელიალიზაციას. -არაინფიცირებული ჭრილობების ეპითელიზაცია 17. ამის საპირისპიროდ, AG1+ ან AG1++ EDTA/BC სამკურნალო საშუალებებთან მკურნალობას არანაირი შედეგი არ მოჰყვა ან აჩვენა, რომ შემცირდა ხელახლა ეპითელიალიზაცია კონტროლთან შედარებით.
ვერცხლის ჭრილობის გასახდელი მოქმედება ჭრილობის შეხორცებაზე არაინფიცირებულ თაგვებში, სრული რეზექციით. (AD) ჭრილობების წარმომადგენლობითი მაკროსკოპული გამოსახულებები სამდღიანი მკურნალობის შემდეგ არა ანტიმიკრობული კონტროლის გასახდელი და ვერცხლის გასახდელი. (ეჰ) წარმომადგენლობითი ჭრილობის სექციები, რომლებიც შეღებილია ჰემატოქსილინით და ეოზინით. ჭრილობის ფართობის (I) რაოდენობრივი რაოდენობა და რეეპითელიალიზაციის პროცენტული მაჩვენებელი (J) გამოითვალა ჰისტოლოგიური მონაკვეთებიდან ჭრილობის შუაგულში, გამოსახულების ანალიზის პროგრამის გამოყენებით (n = 11–12 მკურნალობის ჯგუფში). გრაფიკებში ნაჩვენებია საშუალო +/- სტანდარტული შეცდომა. * ნიშნავს p = <0.05.
ვერცხლს აქვს გამოყენების გრძელი ისტორია, როგორც ანტიმიკრობული თერაპია ჭრილობების შეხორცებაში, მაგრამ მრავალფეროვანმა ფორმულირებამ და მშობიარობის მეთოდებმა შეიძლება გამოიწვიოს ანტიმიკრობული ეფექტურობის განსხვავებები 18. უფრო მეტიც, სპეციფიკური ვერცხლის მიწოდების სისტემების ანტიბიოფილმის თვისებები ბოლომდე არ არის გაგებული. მიუხედავად იმისა, რომ მასპინძელი იმუნური პასუხი შედარებით ეფექტურია პლანქტონური ბაქტერიების წინააღმდეგ, ის ზოგადად ნაკლებად ეფექტურია ბიოფილმსის წინააღმდეგ 19. პლანქტონური ბაქტერიები ადვილად ფაგოციტირებულია მაკროფაგების მიერ, მაგრამ ბიოფილმების შიგნით, საერთო უჯრედები დამატებით პრობლემებს უქმნიან მასპინძლის რეაგირების შეზღუდვას იმ ზომით, რომ იმუნურმა უჯრედებმა შეიძლება გაიარონ აპოპტოზი და გაათავისუფლონ პროინფლამაციური ფაქტორები იმუნური პასუხის გასაძლიერებლად. დაფიქსირდა, რომ ზოგიერთ ლეიკოციტს შეუძლია შეაღწიოს Biofilms21, მაგრამ ვერ ახერხებენ ფაგოციტოზის ბაქტერიების მიღებას, როდესაც ეს დაცვა კომპრომეტირდება 22. ჰოლისტიკური მიდგომა უნდა იქნას გამოყენებული მასპინძლის იმუნური რეაქციის მხარდასაჭერად ჭრილობის ბიოფილმის ინფექციის წინააღმდეგ. ჭრილობის დებრიდენტმა შეიძლება ფიზიკურად შეაფერხოს ბიოფილმი და ამოიღოს ბიობურდენის უმეტესი ნაწილი, მაგრამ მასპინძელი იმუნური პასუხი შეიძლება არაეფექტური იყოს დარჩენილი ბიოფილმის წინააღმდეგ, განსაკუთრებით იმ შემთხვევაში, თუ მასპინძელი იმუნური პასუხი კომპრომეტირდება. ამრიგად, ანტიმიკრობული თერაპიები, როგორიცაა ვერცხლის გასახდელი, ხელს შეუწყობს მასპინძელ იმუნურ პასუხს და აღმოფხვრას ბიოფილმის ინფექციები. შემადგენლობა, კონცენტრაცია, ხსნადობა და მიწოდების სუბსტრატი შეიძლება გავლენა იქონიოს ვერცხლის ანტიმიკრობულ ეფექტურობაზე. ბოლო წლების განმავლობაში, ვერცხლის დამუშავების ტექნოლოგიის მიღწევებმა ეს სამოსები უფრო ეფექტური გახადა 9,23. როგორც ვერცხლის გასახდელი ტექნოლოგია წინსვლის, მნიშვნელოვანია გვესმოდეს ამ სამკერვალო ეფექტურობა ჭრილობის ინფექციის კონტროლში და, რაც მთავარია, ვერცხლის ამ ძლიერი ფორმების გავლენა ჭრილობის გარემოზე და განკურნებაზე.
ამ კვლევაში ჩვენ შევადარეთ ორი მოწინავე ვერცხლისფერი სამკერვალო ეფექტურობას ჩვეულებრივი ვერცხლისფერი სამკერვალოები, რომლებიც წარმოქმნიან Ag1+ იონებს ბიოფილმების წინააღმდეგ, სხვადასხვა ინ ვიტრო და in vivo მოდელების გამოყენებით. ჩვენ ასევე შევაფასეთ ამ სამოსის მოქმედება ჭრილობის გარემოზე და ინფექციისგან დამოუკიდებელი განკურნების შესახებ. მიწოდების მატრიცის გავლენის შესამცირებლად, ტესტირებული ყველა ვერცხლისფერი სამკერვალო შედგებოდა კარბოქსიმეთილცელულოზისგან.
ჩვენი წინასწარი შეფასება ამ ვერცხლისფერი სამკერვალოების წინააღმდეგ Pseudomonas aeruginosa და Staphylococcus aureus- ის კოლონიური ბიოფილმების წინააღმდეგ, გვიჩვენებს, რომ, ტრადიციული AG1+ სამკერვალოებისგან განსხვავებით, ორი მოწინავე ვერცხლისფერი სამკერვალო, AG1++ EDTA/BC და ჟანგბადის მარილი, ეფექტურია 5 -ში. რამდენიმე დღე. გარდა ამისა, ეს გასახდელი ხელს უშლის ბიოფილმის ხელახალი ფორმირებას პლანქტონური ბაქტერიების განმეორებით ზემოქმედების გამო. AG1+ გასახდელი შეიცავს ვერცხლის ქლორიდს, იგივე ვერცხლის ნაერთს და ბაზის მატრიქსს, როგორც AG1++ EDTA/BC, და ჰქონდა შეზღუდული გავლენა ბაქტერიულ სიცოცხლისუნარიანობაზე იმავე პერიოდში ბიოფილმში. დაკვირვება იმის შესახებ სხვაგან 15. ეს შედეგები მხარს უჭერს იმ აზრს, რომ BC და EDTA თამაშობენ დამატებით როლს, რაც ხელს უწყობს ჩაცმის მთლიან ეფექტურობას და რომ AG1+ სამკერვალოებში ამ კომპონენტის არარსებობამ შეიძლება ხელი შეუწყო ინ ვიტრო ეფექტურობის დემონსტრირებას. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ ჟანგბადით Ag მარილის სამკერვალოები, რომლებიც წარმოქმნიან Ag2+ და Ag3+ იონებს, გამოავლინეს უფრო ძლიერი ანტიბაქტერიული ეფექტურობა, ვიდრე AG1+ და AG1++ EDTA/BC- ის მსგავსი დონეები. ამასთან, მაღალი რედოქსის პოტენციალის გამო, გაურკვეველია, რამდენ ხანს რჩება AG3+ იონები აქტიური და ეფექტური ჭრილობის ბიოფილმების წინააღმდეგ და, შესაბამისად, იმსახურებს შემდგომ შესწავლას. გარდა ამისა, არსებობს მრავალი განსხვავებული სამოსი, რომლებიც წარმოქმნიან AG1+ იონებს, რომლებიც არ იქნა გამოცდილი ამ კვლევაში. ეს სამკერვალოები შედგება სხვადასხვა ვერცხლის ნაერთებისგან, კონცენტრაციისა და ბაზის მატრიცებისგან, რამაც შეიძლება გავლენა მოახდინოს AG1+ იონების მიწოდებაზე და მათ ეფექტურობაზე ბიოფილმების მიმართ. აღსანიშნავია ისიც, რომ არსებობს მრავალი განსხვავებული in vitro და in vivo მოდელები, რომლებიც გამოიყენება ბიოფილმების წინააღმდეგ ჭრილობის სამკერვალოების ეფექტურობის შესაფასებლად. გამოყენებული მოდელის ტიპი, ისევე როგორც ამ მოდელებში გამოყენებული მედიის მარილისა და ცილის შემცველობა, გავლენას მოახდენს გასახდელი ეფექტურობაზე. ჩვენს in vivo მოდელში, ჩვენ დავუშვეთ, რომ ბიოფილმს მომწიფებულიყო ინ ვიტრო და შემდეგ გადავიტანეთ იგი ჭრილობის დერმატულ ზედაპირზე. მასპინძელი თაგვის იმუნური პასუხი შედარებით ეფექტურია ჭრილობის მიმართ პლანქტონური ბაქტერიების წინააღმდეგ, რითაც ქმნის ბიოფილმს, როგორც ჭრილობის განკურნება. სექსუალურ ბიოფილმის ჭრილობის დამატება ზღუდავს მასპინძელი იმუნური პასუხის ეფექტურობას ბიოფილმის წარმოქმნაზე, რაც საშუალებას აძლევს სექსუალურ ბიოფილმს დაადგინოს ჭრილობა ჭრილობის შიგნით, სანამ შეხორცება დაიწყებს. ამრიგად, ჩვენი მოდელი საშუალებას გვაძლევს შევაფასოთ ანტიმიკრობული სამკერვალოების ეფექტურობა სექსუალურ ბიოფილმებზე, სანამ ჭრილობები დაიწყებენ განკურნებას.
ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ჩაცმულობის შესაფერისი გავლენას ახდენდა ვერცხლისფერი სამკერვალოების ეფექტურობაზე ინ ვიტროში მოზრდილ ბიოფილმებსა და ღორის კანზე. ჭრილობასთან მჭიდრო კონტაქტი კრიტიკულად ითვლება ჩაცმის ანტიმიკრობული ეფექტურობისთვის 24,25. ჟანგბადით მიღებული მარილების შემცველი სამკურნალო საშუალებები მჭიდრო კონტაქტში იყო სექსუალურ ბიოფილმებთან, რის შედეგადაც 24 საათის შემდეგ ბიოფილმში სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების რაოდენობის მნიშვნელოვანი შემცირება მოხდა. ამის საპირისპიროდ, AG1+ და AG1++ EDTA/BC სამკურნალო საშუალებებით მკურნალობისას, სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების მნიშვნელოვანი რაოდენობა დარჩა. ეს სამკერვალოები შეიცავს ნაკერებს გასახდელი მთელი სიგრძის გასწვრივ, რაც ქმნის მკვდარ ადგილებს, რომლებიც ხელს უშლის ბიოფილმთან მჭიდრო კონტაქტს. ჩვენს ინ ვიტრო კვლევებში, ამ არაკონტაქტურმა ადგილებმა ხელი შეუშალა ბიოფილმის შიგნით სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების მკვლელობას. ჩვენ შევაფასეთ ბაქტერიების სიცოცხლისუნარიანობა მხოლოდ 24 საათის შემდეგ მკურნალობის შემდეგ; დროთა განმავლობაში, რადგან გასახდელი ხდება უფრო გაჯერებული, შეიძლება ნაკლებად მკვდარი სივრცე იყოს, ამ სიცოცხლისუნარიანი ბაქტერიების ფართობის ამცირებს. ამასთან, ეს ხაზს უსვამს გასახდელი შემადგენლობის მნიშვნელობას, არა მხოლოდ ვერცხლის ტიპს გასახდელში.
მიუხედავად იმისა, რომ in vitro კვლევები სასარგებლოა სხვადასხვა ვერცხლის ტექნოლოგიების ეფექტურობის შესადარებლად, ასევე მნიშვნელოვანია გვესმოდეს ამ სამკერვალო მოქმედებების შედეგები ბიოფილმებზე in vivo, სადაც მასპინძელი ქსოვილი და იმუნური პასუხები ხელს უწყობს ბიოფილმების საწინააღმდეგო სამკერვალოების ეფექტურობას. ამ სამკერვალოების გავლენა ჭრილობის ბიოფილმებზე დაფიქსირდა ელექტრონული მიკროსკოპის სკანირების და ბიოფილმის შეღებვის სკანირების გამოყენებით, უჯრედული და უჯრედული დნმ -ის საღებავების გამოყენებით. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ 3 დღის მკურნალობის შემდეგ, ყველა სამკერვალო ეფექტური იყო ბიოფილმით ინფიცირებულ ჭრილობებში უჯრედული თავისუფალი დნმ-ის შემცირებაში, მაგრამ AG1+ გასახდელი ნაკლებად ეფექტური იყო Staphylococcus aureus- ის ინფიცირებულ ჭრილობებში. ელექტრონული მიკროსკოპის სკანირებამ ასევე აჩვენა, რომ მნიშვნელოვნად ნაკლები ბაქტერიები იყო წარმოდგენილი ჭრილობებში, რომლებიც მკურნალობდნენ ვერცხლისფერი სამკერვალოებით, თუმცა ეს უფრო გამოხატული იყო ჟანგბადით Ag მარილის გასახდელი და AG1++ EDTA/BC გასახდელი Ag1+ გასახდელთან შედარებით. ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ ტესტირებულ ვერცხლისფერი სამკერვალოები გავლენას ახდენენ ბიოფილმების სტრუქტურაზე, მაგრამ ვერც ერთ ვერცხლის ტანსაცმელს არ შეეძლო ბიოფილმის აღმოფხვრა, რაც ხელს უწყობს ჰოლისტიკური მიდგომის საჭიროებას ჭრილობის ბიოფილმური ინფექციების მკურნალობის შესახებ; ვერცხლის მკლავების გამოყენება. მკურნალობას წინ უძღვის ფიზიკური დებრიდენტი ბიოფილმის უმეტესი ნაწილის მოსაშორებლად.
ქრონიკული ჭრილობები ხშირად მძიმე ანთების მდგომარეობაშია, ჭარბი ანთებითი უჯრედები ჭრილობის ქსოვილში რჩება დროის გახანგრძლივებული პერიოდის განმავლობაში, რაც იწვევს ქსოვილების დაზიანებას და ამცირებს ჟანგბადს, რომელიც საჭიროა უჯრედული მეტაბოლიზმის ეფექტური მეტაბოლიზმისთვის და ფუნქციონირებს ჭრილობაში 26. ბიოფილმები ამძაფრებს ამ მტრულ ჭრილობის გარემოზე უარყოფითად გავლენას ახდენს განკურნების სხვადასხვა გზით, მათ შორის უჯრედების გამრავლების ინჰიბირებით და მიგრაციისა და პროინფლემატორული ციტოკინების 27 -ის გააქტიურებაში. რადგან ვერცხლისფერი სამკერვალო უფრო ეფექტური ხდება, მნიშვნელოვანია იმის გაგება, თუ რა გავლენა მოახდინა მათ ჭრილობის გარემოზე და განკურნებაზე.
საინტერესოა, რომ მიუხედავად იმისა, რომ ყველა ვერცხლისფერმა დაზარალდა ბიოფილმის შემადგენლობა, მხოლოდ ჟანგბადიანი ვერცხლის მარილის სამკერვალოები გაზარდა ამ ინფიცირებული ჭრილობების ხელახალი ეპითელიალიზაცია. ეს მონაცემები მხარს უჭერს ჩვენს წინა დასკვნებს 17 და კალან და სხვ. (2017) 28, რომელმაც აჩვენა ჟანგბადიანი ვერცხლის მარილების კარგი უსაფრთხოება და ტოქსიკურობის პროფილები, რადგან ვერცხლის უფრო დაბალი კონცენტრაცია ეფექტური იყო ბიოფილმების წინააღმდეგ.
ჩვენი ამჟამინდელი კვლევა ხაზს უსვამს ვერცხლის ტექნოლოგიის განსხვავებებს ანტიმიკრობული ვერცხლის გასახდობებსა და ამ ტექნოლოგიის გავლენას ჭრილობის გარემოზე და ინფექციისგან დამოუკიდებელ განკურნებას შორის. ამასთან, ეს შედეგები განსხვავდება წინა კვლევებისაგან, რომლებიც აჩვენებს, რომ AG1 + + EDTA/BC ჩაცმის გაუმჯობესდა დაზარალებული კურდღლის ყურების სამკურნალო პარამეტრები in vivo. ამასთან, ეს შეიძლება გამოწვეული იყოს ცხოველების მოდელებში, გაზომვის დროში და ბაქტერიული გამოყენების მეთოდების განსხვავებებით 29. ამ შემთხვევაში, ჭრილობის გაზომვები მიიღეს ტრავმის შემდეგ 12 დღის შემდეგ, რათა ჩაცმის აქტიური ინგრედიენტები იმოქმედონ ბიოფილმზე უფრო გრძელი პერიოდის განმავლობაში. ამას მხარს უჭერს გამოკვლევა, რომელიც აჩვენებს, რომ კლინიკურად დაინფიცირებული ფეხის წყლულები, რომლებიც მკურნალობდნენ AG1 + + EDTA/BC– ით, თავდაპირველად გაიზარდა ზომით მკურნალობის ერთი კვირის შემდეგ, შემდეგ კი მკურნალობის მომდევნო 3 კვირის განმავლობაში AG1 + + EDTA/BC– ით და 4 კვირის განმავლობაში არა-ანტიიმიკრობების გამოყენება. ნარკოტიკები. CMC სამკერვალოები წყლულების ზომების შესამცირებლად.
ვერცხლის გარკვეული ფორმები და კონცენტრაცია ადრე იყო ნაჩვენები, რომ ციტოტოქსიურია in vitro 11, მაგრამ ეს in vitro შედეგები ყოველთვის არ ითარგმნება უარყოფით ეფექტებად in vivo. გარდა ამისა, ვერცხლის ტექნოლოგიის მიღწევებმა და ვერცხლის ნაერთების უკეთ გააზრებამ და საკვებად კონცენტრაციამ გამოიწვია მრავალი უსაფრთხო და ეფექტური ვერცხლისფერი სამკერვალო. ამასთან, როგორც ვერცხლის გასახდელი ტექნოლოგია წინსვლის, მნიშვნელოვანია გვესმოდეს ამ სამოსის გავლენა ჭრილობის გარემოზე 31,32,33. ადრე გავრცელდა ინფორმაცია, რომ რე-ეპითელიალიზაციის გაზრდილი მაჩვენებელი შეესაბამება ანთების საწინააღმდეგო M2 მაკროფაგების გაზრდას პროპორციულად, ანთების საწინააღმდეგო M1 ფენოტიპთან შედარებით. ეს აღინიშნა თაგვის წინა მოდელში, სადაც ვერცხლის ჰიდროგელის ჭრილობის სამკერვალოები შეადარეს ვერცხლის სულფადიაზინს და არა-ანტიიმიკრობულ ჰიდროგელსს 34.
ქრონიკულმა ჭრილობებმა შეიძლება გამოავლინოს ზედმეტი ანთება და დაფიქსირდა, რომ ჭარბი ნეიტროფილების არსებობა შეიძლება საზიანო იყოს ჭრილობის შეხორცებისთვის 35. ნეიტროფილების დაქვეითებულ თაგვებში ჩატარებულ კვლევაში, ნეიტროფილების არსებობამ შეაჩერა რეეპითელიზაცია. ჭარბი ნეიტროფილების არსებობა იწვევს პროტეაზების მაღალ დონეს და ჟანგბადის რეაქტიულ სახეობებს, როგორიცაა სუპეროქსიდი და წყალბადის ზეჟანგი, რომლებიც ასოცირდება ქრონიკულ და ნელი სამკერვალო ჭრილობებთან 37,38. ანალოგიურად, მაკროფაგების რიცხვების ზრდამ, თუ უკონტროლოა, შეიძლება გამოიწვიოს ჭრილობის შეფერხება 39. ეს ზრდა განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია იმ შემთხვევაში, თუ მაკროფაგები ვერ ახერხებენ ანთების საწინააღმდეგო ფენოტიპიდან პრო-სამკერვალო ფენოტიპზე გადასვლას, რის შედეგადაც ჭრილობები ვერ ახერხებენ სამკურნალო ანთებითი ფაზის გასვლას. ჩვენ დავაფიქსირეთ ნეიტროფილებისა და მაკროფაგების დაქვეითება ბიოფილმის ინფიცირებულ ჭრილობებში 3 დღის განმავლობაში მკურნალობის შემდეგ, ყველა ვერცხლისფერი სამკერვალო, მაგრამ შემცირება უფრო გამოხატული იყო ჟანგბადით მარილის სამკერვალოზე. ეს დაქვეითება შეიძლება იყოს ვერცხლის იმუნური პასუხის პირდაპირი შედეგი, ბიობურდენის დაქვეითების პასუხი, ან ჭრილობა სამკურნალო შემდგომ ეტაპზე და, შესაბამისად, ჭრილობის იმუნური უჯრედები მცირდება. ჭრილობაში ანთებითი უჯრედების რაოდენობის შემცირებამ შეიძლება შეინარჩუნოს ჭრილობის შეხორცება. მოქმედების მექანიზმი იმის შესახებ, თუ როგორ უწყობს ხელს Ag oxySalts ინფექციით დამოუკიდებელ განკურნებას, გაურკვეველია, მაგრამ Ag oxySalts- ის შესაძლებლობამ ჟანგბადის წარმოქმნა და წყალბადის ზეჟანგით მავნე დონის განადგურება, ანთების შუამავლობით, შეიძლება აიხსნას ეს და მოითხოვს შემდგომ შესწავლას 17.
ქრონიკული არა საცვლების ინფიცირებული ჭრილობები პრობლემას უქმნის როგორც ექიმებს, ასევე პაციენტებს. მიუხედავად იმისა, რომ მრავალი სამკერვალო აცხადებს ანტიმიკრობულ ეფექტურობას, კვლევა იშვიათად ფოკუსირდება ჭრილობის მიკრო გარემოში გავლენის სხვა მნიშვნელოვან ფაქტორებზე. ეს გამოკვლევა აჩვენებს, რომ სხვადასხვა ვერცხლის ტექნოლოგიას აქვს განსხვავებული ანტიმიკრობული ეფექტურობა და, რაც მთავარია, სხვადასხვა გავლენას ახდენს ჭრილობის გარემოზე და განკურნებაზე, ინფექციისგან დამოუკიდებლად. მიუხედავად იმისა, რომ ეს in vitro და in vivo გამოკვლევები აჩვენებს ამ სამკერვალოების ეფექტურობას ჭრილობის ინფექციების სამკურნალოდ და განკურნების ხელშეწყობაში, საჭიროა რანდომიზებული კონტროლირებადი კვლევები კლინიკაში ამ სამკერვალოების ეფექტურობის შესაფასებლად.
მიმდინარე კვლევის დროს გამოყენებული ან/და გაანალიზებული მონაცემთა ბაზა შესაბამისი ავტორისგან არის შესაძლებელი გონივრული მოთხოვნით.