ადამიანის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ჰეტეროგენულობა მიოზინის მძიმე ჯაჭვის მიღმა

გმადლობთ, რომ ეწვიეთ nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ ბრაუზერის უახლესი ვერსია (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). გარდა ამისა, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, ეს საიტი თავისუფალი იქნება სტილებისა და JavaScript-ისგან.
ჩონჩხის კუნთი ჰეტეროგენული ქსოვილია, რომელიც ძირითადად მიოფიბრილებისგან შედგება, რომლებიც ადამიანებში, როგორც წესი, სამ ტიპად კლასიფიცირდება: ერთი „ნელი“ (ტიპი 1) და ორი „სწრაფი“ (ტიპები 2A და 2X). თუმცა, ტრადიციულ მიოფიბრილების ტიპებს შორის და მათ შიგნით ჰეტეროგენულობა ჯერ კიდევ ბოლომდე შესწავლილი არ არის. ჩვენ გამოვიყენეთ ტრანსკრიპტომიული და პროტეომიკური მიდგომები ადამიანის გვერდითი კუნთის 1050 და 1038 ინდივიდუალურ მიოფიბრილზე, შესაბამისად. პროტეომიკურ კვლევაში მონაწილეობდნენ მამაკაცები, ხოლო ტრანსკრიპტომიურ კვლევაში - 10 მამაკაცი და 2 ქალი. მიოზინის მძიმე ჯაჭვის იზოფორმების გარდა, ჩვენ გამოვავლინეთ მეტაბოლური ცილები, რიბოსომული ცილები და უჯრედული შეერთების ცილები, როგორც მრავალგანზომილებიანი ინტერმიოფიბრილური ცვალებადობის წყაროები. გარდა ამისა, ნელი და სწრაფი ბოჭკოების კლასტერების იდენტიფიცირების მიუხედავად, ჩვენი მონაცემები მიუთითებს, რომ 2X ტიპის ბოჭკოები ფენოტიპურად არ განსხვავდება სხვა სწრაფად შეკუმშვადი ბოჭკოებისგან. გარდა ამისა, მიოზინის მძიმე ჯაჭვზე დაფუძნებული კლასიფიკაცია არასაკმარისია ნემალინის მიოპათიებში მიოფიბრის ფენოტიპის აღსაწერად. საერთო ჯამში, ჩვენი მონაცემები მიუთითებს მრავალგანზომილებიან მიოფიბერულ ჰეტეროგენულობაზე, რომლის ვარიაციის წყაროებიც მიოზინის მძიმე ჯაჭვის იზოფორმებს სცილდება.
უჯრედული ჰეტეროგენულობა ყველა ბიოლოგიური სისტემის თანდაყოლილი მახასიათებელია, რაც უჯრედებს საშუალებას აძლევს სპეციალიზდნენ ქსოვილებისა და უჯრედების სხვადასხვა საჭიროებების დასაკმაყოფილებლად.1 ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის ტრადიციული შეხედულება იყო ის, რომ მოტორული ნეირონები განსაზღვრავენ ბოჭკოების ტიპს მოტორულ ერთეულში და რომ ბოჭკოების ტიპი (ანუ ტიპი 1, ტიპი 2A და ტიპი 2X ადამიანებში) განისაზღვრება მიოზინის მძიმე ჯაჭვის (MYH) იზოფორმების მახასიათებლებით.2 თავდაპირველად ეს ეფუძნებოდა მათ pH ATPase-ის არასტაბილურობას,3,4 ხოლო მოგვიანებით MYH-ის მოლეკულურ ექსპრესიას.5 თუმცა, „შერეული“ ბოჭკოების იდენტიფიცირებით და შემდგომი მიღებით, რომლებიც სხვადასხვა პროპორციით ერთდროულად გამოხატავენ მრავალ MYH-ს, ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოები სულ უფრო მეტად განიხილება, როგორც უწყვეტობა და არა როგორც ცალკეული ბოჭკოების ტიპები.6 ამის მიუხედავად, სფერო კვლავ დიდად ეყრდნობა MYH-ს, როგორც მიოფიბერების კლასიფიკაციის ძირითად კლასიფიკატორს, შეხედულებაზე, რომელიც, სავარაუდოდ, გავლენას ახდენს მღრღნელების ადრეული კვლევების შეზღუდვებზე და მნიშვნელოვან მიკერძოებებზე, რომელთა MYH-ის ექსპრესიის პროფილები და ბოჭკოების ტიპების დიაპაზონი განსხვავდება ადამიანებში არსებულისგან.2 სიტუაციას კიდევ უფრო ართულებს ის ფაქტი, რომ ადამიანის სხვადასხვა ჩონჩხის კუნთები ავლენენ ბოჭკოების ტიპების მრავალფეროვან სპექტრს.7 vastus lateralis შერეული კუნთია MYH-ის შუალედური (და შესაბამისად, წარმომადგენლობითი) ექსპრესიის პროფილით.7 გარდა ამისა, მისი ნიმუშების აღების სიმარტივე მას ადამიანებში ყველაზე კარგად შესწავლილ კუნთად აქცევს.
ამგვარად, ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების მრავალფეროვნების მიუკერძოებელი კვლევა ძლიერი „ომიკის“ ინსტრუმენტების გამოყენებით კრიტიკულად მნიშვნელოვანია, მაგრამ ასევე რთული, ნაწილობრივ ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების მრავალბირთვიანი ბუნების გამო. თუმცა, ტრანსკრიპტომიკის8,9 და პროტეომიკის10 ტექნოლოგიებმა ბოლო წლებში მგრძნობელობის რევოლუცია განიცადეს სხვადასხვა ტექნოლოგიური მიღწევების გამო, რაც ჩონჩხის კუნთების ანალიზის საშუალებას იძლევა ერთი ბოჭკოს გარჩევადობით. შედეგად, მნიშვნელოვანი პროგრესი იქნა მიღწეული ერთი ბოჭკოს მრავალფეროვნების და მათი ატროფიულ სტიმულებსა და დაბერებაზე რეაქციის დახასიათებაში11,12,13,14,15,16,17,18. მნიშვნელოვანია, რომ ამ ტექნოლოგიურ მიღწევებს აქვთ კლინიკური გამოყენება, რაც საშუალებას იძლევა დაავადებასთან დაკავშირებული დისრეგულაციის უფრო დეტალური და ზუსტი დახასიათების. მაგალითად, ნემალინის მიოპათიის პათოფიზიოლოგია, ერთ-ერთი ყველაზე გავრცელებული მემკვიდრეობითი კუნთოვანი დაავადება (MIM 605355 და MIM 161800), რთული და დამაბნეველია.19,20 ამიტომ, ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების დისრეგულაციის უკეთესმა დახასიათებამ შეიძლება მნიშვნელოვანი წინსვლა გამოიწვიოს ამ დაავადების გაგებაში.
ჩვენ შევიმუშავეთ ადამიანის ბიოფსიის ნიმუშებიდან ხელით იზოლირებული ცალკეული ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ტრანსკრიპტომიული და პროტეომიკური ანალიზის მეთოდები და გამოვიყენეთ ისინი ათასობით ბოჭკოზე, რამაც საშუალება მოგვცა გამოგვეკვლია ადამიანის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების უჯრედული ჰეტეროგენულობა. ამ ნაშრომის ფარგლებში ჩვენ ვაჩვენეთ კუნთოვანი ბოჭკოების ტრანსკრიპტომიული და პროტეომიკური ფენოტიპირების ძალა და გამოვავლინეთ მეტაბოლური, რიბოსომული და უჯრედული შეერთების ცილები, როგორც ბოჭკოებს შორის ცვალებადობის მნიშვნელოვანი წყაროები. გარდა ამისა, ამ პროტეომიკური სამუშაო პროცესის გამოყენებით, ჩვენ დავახასიათეთ ნემატოდური მიოპათიის კლინიკური მნიშვნელობა ცალკეულ ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში, რამაც გამოავლინა კოორდინირებული გადასვლა არაოქსიდაციური ბოჭკოებისკენ, ბოჭკოს ტიპისგან დამოუკიდებლად, MYH-ის საფუძველზე.
ადამიანის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის შესასწავლად, ჩვენ შევიმუშავეთ ორი სამუშაო ნაკადი, რათა უზრუნველვყოთ ცალკეული ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ტრანსკრიპტომისა და პროტეომის ანალიზი (სურათი 1A და დამატებითი სურათი 1A). ჩვენ შევიმუშავეთ და ოპტიმიზაცია გავუკეთეთ რამდენიმე მეთოდოლოგიურ ეტაპს, ნიმუშის შენახვიდან და რნმ-ისა და ცილის მთლიანობის შენარჩუნებიდან დაწყებული, თითოეული მიდგომისთვის გამტარუნარიანობის ოპტიმიზაციამდე. ტრანსკრიპტომის ანალიზისთვის ეს მიღწეული იქნა ნიმუშისთვის სპეციფიკური მოლეკულური შტრიხკოდების ჩასმით უკუ ტრანსკრიფციის საწყის ეტაპზე, რამაც საშუალება მისცა 96 ბოჭკოს გაერთიანებას ეფექტური შემდგომი დამუშავებისთვის. უფრო ღრმა სეკვენირებამ (±1 მილიონი წაკითხვა თითო ბოჭკოზე) ტრადიციულ ერთუჯრედიან მიდგომებთან შედარებით, კიდევ უფრო გაამდიდრა ტრანსკრიპტომის მონაცემები.21 პროტეომიკისთვის, ჩვენ გამოვიყენეთ მოკლე ქრომატოგრაფიული გრადიენტი (21 წუთი), რომელიც შერწყმულია DIA-PASEF მონაცემთა მიღებასთან timsTOF მას-სპექტრომეტრზე, რათა ოპტიმიზებულიყო პროტეომის სიღრმე მაღალი გამტარუნარიანობის შენარჩუნებით. 22,23 ჯანსაღი ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის შესასწავლად, ჩვენ დავახასიათეთ 14 ჯანმრთელი ზრდასრული დონორის 1050 ცალკეული ბოჭკოს ტრანსკრიპტომები და 5 ჯანმრთელი ზრდასრული დონორის 1038 ბოჭკოს პროტეომები (დამატებითი ცხრილი 1). ამ ნაშრომში, ეს მონაცემთა ნაკრებები შესაბამისად მოიხსენიება, როგორც 1000 ბოჭკოვანი ტრანსკრიპტომები და პროტეომები. ჩვენმა მიდგომამ 1000 ბოჭკოვანი ტრანსკრიპტომული და პროტეომიკური ანალიზებით აღმოაჩინა სულ 27,237 ტრანსკრიპტი და 2,983 ცილა (სურათი 1A, დამატებითი მონაცემთა ნაკრებები 1-2). ტრანსკრიპტომული და პროტეომიკური მონაცემთა ნაკრებების ფილტრაციის შემდეგ 1000-ზე მეტი აღმოჩენილი გენის და თითო ბოჭკოზე 50%-იანი ვალიდური მნიშვნელობების დასადგენად, შემდგომი ბიოინფორმატიკური ანალიზები ჩატარდა შესაბამისად 925 და 974 ბოჭკოსთვის ტრანსკრიპტომსა და პროტეომაში. ფილტრაციის შემდეგ, თითოეულ ბოჭკოზე საშუალოდ 4257 ± 1557 გენი და 2015 ± 234 ცილა (საშუალო ± სტანდარტული გადახრა) იქნა აღმოჩენილი, შეზღუდული ინდივიდებს შორის ცვალებადობით (დამატებითი ნახაზები 1B–C, დამატებითი მონაცემთა ნაკრებები 3–4). თუმცა, სუბიექტის შიგნით ცვალებადობა უფრო გამოხატული იყო მონაწილეებს შორის, სავარაუდოდ, სხვადასხვა სიგრძისა და განივი კვეთის ფართობის ბოჭკოებს შორის რნმ/ცილის მოსავლიანობის განსხვავებების გამო. ცილების უმეტესობისთვის (>2000), ვარიაციის კოეფიციენტი 20%-ზე ნაკლები იყო (დამატებითი სურათი 1D). ორივე მეთოდი საშუალებას იძლეოდა აღებეჭდა ტრანსკრიპტებისა და ცილების ფართო დინამიური დიაპაზონი კუნთების შეკუმშვისთვის მნიშვნელოვანი მაღალგამოხატული ხელმოწერებით (მაგ., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (დამატებითი ნახაზები 1E–F). იდენტიფიცირებული მახასიათებლების უმეტესობა საერთო იყო ტრანსკრიპტომიულ და პროტეომიკურ მონაცემთა ნაკრებებს შორის (დამატებითი სურათი 1G) და ამ მახასიათებლების საშუალო UMI/LFQ ინტენსივობა საკმაოდ კარგად იყო კორელირებული (r = 0.52) (დამატებითი სურათი 1H).
ტრანსკრიპტომიკისა და პროტეომიკის სამუშაო პროცესი (შექმნილია BioRender.com-ის გამოყენებით). BD MYH7, MYH2 და MYH1-ის დინამიური დიაპაზონის მრუდები და ბოჭკოების ტიპის მინიჭების გამოთვლილი ზღურბლები. E, F MYH ექსპრესიის განაწილება ბოჭკოებს შორის ტრანსკრიპტომიკისა და პროტეომიკის მონაცემთა ნაკრებებში. G, H ერთგვაროვანი მრავალფეროვნების მიახლოებისა და პროექციის (UMAP) დიაგრამები ტრანსკრიპტომიკებისა და პროტეომიკებისთვის, შეფერილი MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოების ტიპის მიხედვით. I, J მახასიათებლების დიაგრამები, რომლებიც აჩვენებს MYH7, MYH2 და MYH1 ექსპრესიას ტრანსკრიპტომიკისა და პროტეომიკის მონაცემთა ნაკრებებში.
თავდაპირველად, ჩვენ გადავწყვიტეთ, თითოეული ბოჭკოსთვის MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოს ტიპი მიგვეკუთვნებინა ოპტიმიზებული მიდგომის გამოყენებით, რომელიც იყენებს MYH ექსპრესიის მაღალ მგრძნობელობას და დინამიურ დიაპაზონს ომიკის მონაცემთა ნაკრებებში. წინა კვლევებში გამოყენებული იყო თვითნებური ზღურბლები ბოჭკოების წმინდა 1 ტიპის, 2A ტიპის, 2X ტიპის ან შერეული, სხვადასხვა MYH-ების ექსპრესიის ფიქსირებული პროცენტული მაჩვენებლის მიხედვით11,14,24. ჩვენ გამოვიყენეთ განსხვავებული მიდგომა, რომლის დროსაც თითოეული ბოჭკოს ექსპრესია რანჟირებული იყო ბოჭკოების ტიპირებისთვის გამოყენებული MYH-ების მიხედვით: MYH7, MYH2 და MYH1, რომლებიც შეესაბამება შესაბამისად 1 ტიპის, 2A ტიპის და 2X ტიპის ბოჭკოებს. შემდეგ მათემატიკურად გამოვთვალეთ თითოეული მიღებული მრუდის ქვედა გადახრის წერტილი და გამოვიყენეთ ის, როგორც ზღურბლი, რათა ბოჭკოები თითოეული MYH-სთვის დადებითად (ზღურბლზე მაღლა) ან უარყოფითად (ზღურბლზე ქვემოთ) მიგვენიჭებინა (სურათი 1B–D). ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ MYH7-ს (სურათი 1B) და MYH2-ს (სურათი 1C) აქვთ უფრო განსხვავებული ჩართვა/გამორთვის ექსპრესიის პროფილები რნმ-ის დონეზე, ცილის დონეზე შედარებით. მართლაც, ცილის დონეზე, ძალიან ცოტა ბოჭკო არ გამოხატავდა MYH7-ს და არცერთ ბოჭკოს არ ჰქონდა MYH2-ის 100%-იანი ექსპრესია. შემდეგ ჩვენ გამოვიყენეთ წინასწარ განსაზღვრული ექსპრესიის ზღურბლები, რათა თითოეულ მონაცემთა ნაკრებში ყველა ბოჭკოსთვის MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოების ტიპები მიგვენიჭებინა. მაგალითად, MYH7+/MYH2-/MYH1- ბოჭკოები მიენიჭა 1 ტიპს, ხოლო MYH7-/MYH2+/MYH1+ ბოჭკოები მიენიჭა შერეულ ტიპ 2A/2X-ს (სრული აღწერილობისთვის იხილეთ დამატებითი ცხრილი 2). ყველა ბოჭკოს გაერთიანებით, ჩვენ დავაკვირდით MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოების ტიპების საოცრად მსგავს განაწილებას როგორც რნმ-ის (სურათი 1E), ასევე ცილის (სურათი 1F) დონეზე, ხოლო MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოების ტიპების ფარდობითი შემადგენლობა განსხვავდებოდა ინდივიდებს შორის, როგორც მოსალოდნელი იყო (დამატებითი სურათი 2A). ბოჭკოების უმეტესობა კლასიფიცირებული იყო როგორც სუფთა ტიპი 1 (34–35%), ასევე ტიპი 2A (36–38%), თუმცა ასევე აღმოჩენილი იქნა შერეული ტიპის 2A/2X ბოჭკოების მნიშვნელოვანი რაოდენობა (16–19%). გასაოცარი განსხვავება ისაა, რომ სუფთა ტიპის 2X ბოჭკოების აღმოჩენა მხოლოდ რნმ-ის დონეზეა შესაძლებელი და არა ცილის დონეზე, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ MYH-ის სწრაფი ექსპრესია, სულ მცირე, ნაწილობრივ მაინც რეგულირდება ტრანსკრიფციის შემდეგ.
ჩვენ დავადასტურეთ ჩვენი პროტეომიკაზე დაფუძნებული MYH ბოჭკოების ტიპირების მეთოდი ანტისხეულებზე დაფუძნებული წერტილოვანი ბლოტინგის გამოყენებით და ორივე მეთოდმა მიაღწია 100%-იან თანხვედრას სუფთა ტიპი 1 და ტიპი 2A ბოჭკოების იდენტიფიცირებაში (იხილეთ დამატებითი სურათი 2B). თუმცა, პროტეომიკაზე დაფუძნებული მიდგომა უფრო მგრძნობიარე და ეფექტური იყო შერეული ბოჭკოების იდენტიფიცირებისა და თითოეულ ბოჭკოში თითოეული MYH გენის პროპორციის რაოდენობრივი განსაზღვრის თვალსაზრისით. ეს მონაცემები აჩვენებს ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ტიპების დასახასიათებლად ობიექტური, მაღალმგრძნობიარე ომიკაზე დაფუძნებული მიდგომის გამოყენების ეფექტურობას.
შემდეგ ტრანსკრიპტომიკისა და პროტეომიკის მიერ მოწოდებული კომბინირებული ინფორმაცია გამოვიყენეთ მიოფიბრების ობიექტურად კლასიფიკაციისთვის მათი სრული ტრანსკრიპტომის ან პროტეომის მიხედვით. განზომილების ექვს მთავარ კომპონენტამდე შესამცირებლად ერთგვაროვანი მანიფოლდური აპროქსიმაციისა და პროექციის (UMAP) მეთოდის გამოყენებით (დამატებითი სურათები 3A–B), ჩვენ შევძელით მიოფიბრების ცვალებადობის ვიზუალიზაცია ტრანსკრიპტომში (სურათი 1G) და პროტეომაში (სურათი 1H). აღსანიშნავია, რომ მიოფიბრები არ იყო დაჯგუფებული მონაწილეების (დამატებითი სურათები 3C–D) ან ტესტირების დღეების (დამატებითი სურათ 3E) მიხედვით არც ტრანსკრიპტომიკის და არც პროტეომიკის მონაცემთა ნაკრებებში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში სუბიექტის შიგნით ცვალებადობა უფრო მაღალია, ვიდრე სუბიექტებს შორის ცვალებადობა. UMAP დიაგრამაში გამოიკვეთა ორი განსხვავებული კლასტერი, რომლებიც წარმოადგენენ „სწრაფ“ და „ნელ“ მიოფიბრებს (სურათები 1G–H). MYH7+ (ნელი) მიოფიბრები UMAP1-ის დადებით პოლუსზე იყო დაჯგუფებული, ხოლო MYH2+ და MYH1+ (სწრაფი) მიოფიბრები UMAP1-ის უარყოფით პოლუსზე იყო დაჯგუფებული (სურათები 1I–J). თუმცა, MYH ექსპრესიის მიხედვით სწრაფად შეკუმშვადი ბოჭკოების ტიპებს (ანუ ტიპი 2A, ტიპი 2X ან შერეული 2A/2X) შორის განსხვავება არ გაკეთებულა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ MYH1 (სურათი 1I–J) ან სხვა კლასიკური 2X მიოფიბრების მარკერები, როგორიცაა ACTN3 ან MYLK2 (დამატებითი სურათები 4A–B) ექსპრესია არ განასხვავებს მიოფიბრების სხვადასხვა ტიპებს მთლიანი ტრანსკრიპტომის ან პროტეომის განხილვისას. უფრო მეტიც, MYH2-თან და MYH7-თან შედარებით, რამდენიმე ტრანსკრიპტი ან ცილა დადებითად კორელირებდა MYH1-თან (დამატებითი სურათები 4C–H), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ MYH1-ის სიმრავლე სრულად არ ასახავს მიოფიბრების ტრანსკრიპტომს/პროტეომას. მსგავსი დასკვნები იქნა გამოტანილი სამი MYH იზოფორმის შერეული ექსპრესიის UMAP დონეზე შეფასებისას (დამატებითი სურ. 4I–J). ამრიგად, მიუხედავად იმისა, რომ 2X ბოჭკოების იდენტიფიცირება ტრანსკრიპტის დონეზე შესაძლებელია მხოლოდ MYH რაოდენობრივი განსაზღვრის საფუძველზე, MYH1+ ბოჭკოები არ გამოირჩევა სხვა სწრაფი ბოჭკოებისგან მთლიანი ტრანსკრიპტომის ან პროტეომის განხილვისას.
MYH-ის მიღმა ნელი ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის საწყისი შესწავლის მიზნით, ჩვენ შევაფასეთ ოთხი დადგენილი ნელი ბოჭკოების ტიპ-სპეციფიკური ცილა: TPM3, TNNT1, MYL3 და ATP2A22. ნელი ბოჭკოების ქვეტიპებმა აჩვენეს მაღალი, თუმცა არა სრულყოფილი, პირსონის კორელაცია MYH7-თან როგორც ტრანსკრიპტომიკაში (დამატებითი სურათი 5A), ასევე პროტეომიკაში (დამატებითი სურათი 5B). ნელი ბოჭკოების დაახლოებით 25% და 33% არ იყო კლასიფიცირებული, როგორც სუფთა ნელი ბოჭკოები ყველა გენ/ცილის ქვეტიპის მიხედვით, შესაბამისად, ტრანსკრიპტომიკაში (დამატებითი სურათი 5C) და პროტეომიკაში (დამატებითი სურათი 5D). ამრიგად, ნელი ბოჭკოების კლასიფიკაცია, რომელიც დაფუძნებულია მრავალ გენ/ცილის ქვეტიპზე, დამატებით სირთულეს ქმნის, თუნდაც ბოჭკოების ტიპ-სპეციფიკურ ცილებზე. ეს იმაზე მიუთითებს, რომ ერთი გენ/ცილის ოჯახის იზოფორმებზე დაფუძნებული ბოჭკოების კლასიფიკაცია შესაძლოა სათანადოდ არ ასახავდეს ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ნამდვილ ჰეტეროგენულობას.
ადამიანის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ფენოტიპური ცვალებადობის შემდგომი შესწავლის მიზნით, მთელი ომიკის მოდელის მასშტაბით, ჩვენ ჩავატარეთ მონაცემების მიუკერძოებელი განზომილების შემცირება მთავარი კომპონენტის ანალიზის (PCA) გამოყენებით (სურათი 2A). UMAP დიაგრამების მსგავსად, არც მონაწილემ და არც ტესტირების დღემ გავლენა არ მოახდინა ბოჭკოების კლასტერიზაციაზე PCA დონეზე (დამატებითი სურათები 6A–C). ორივე მონაცემთა ნაკრებში, MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოების ტიპი აიხსნა PC2-ით, რომელიც აჩვენებდა ნელა შეკუმშვის ტიპის 1 ბოჭკოების კლასტერს და მეორე კლასტერს, რომელიც შეიცავდა სწრაფად შეკუმშვის ტიპის 2A, ტიპის 2X და შერეულ 2A/2X ბოჭკოებს (სურათი 2A). ორივე მონაცემთა ნაკრებში, ეს ორი კლასტერი დაკავშირებული იყო შერეული ტიპის 1/2A ბოჭკოების მცირე რაოდენობით. როგორც მოსალოდნელი იყო, PC-ს ძირითადი მამოძრავებელი ფაქტორების გადაჭარბებული წარმოდგენის ანალიზმა დაადასტურა, რომ PC2-ს მართავდა შეკუმშვისა და მეტაბოლური ხელმოწერები (სურათი 2B და დამატებითი სურათები 6D–E, დამატებითი მონაცემთა ნაკრებები 5–6). საერთო ჯამში, MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოვანი ტიპი საკმარისი აღმოჩნდა PC2-ის გასწვრივ უწყვეტი ვარიაციის ასახსნელად, გარდა ე.წ. 2X ბოჭკოებისა, რომლებიც განაწილებული იყო ტრანსკრიპტომის მთელ სწრაფ კლასტერში.
A. ტრანსკრიპტომებისა და პროტეომების მონაცემთა ნაკრებების ძირითადი კომპონენტების ანალიზის (PCA) დიაგრამები, რომლებიც შეფერილია ბოჭკოს ტიპის მიხედვით MYH-ის მიხედვით. B. ტრანსკრიპტისა და ცილის დრაივერების გამდიდრების ანალიზი PC2-სა და PC1-ში. სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა clusterProfiler პაკეტისა და Benjamini-Hochberg-ის კორექტირებული p-მნიშვნელობების გამოყენებით. C, D. PCA დიაგრამები შეფერილია უჯრედშორისი ადჰეზიის გენის ონტოლოგიის (GO) ტერმინების მიხედვით ტრანსკრიპტომსა და კოსტამერის GO ტერმინებში პროტეომაში. ისრები წარმოადგენენ ტრანსკრიპტისა და ცილის დრაივერებს და მათ მიმართულებებს. E, F. კლინიკურად მნიშვნელოვანი მახასიათებლების ერთგვაროვანი მანიფოლდური აპროქსიმაციისა და პროექციის (UMAP) მახასიათებლების დიაგრამები, რომლებიც აჩვენებს ექსპრესიის გრადიენტებს, რომლებიც დამოუკიდებელია ნელი/სწრაფი ბოჭკოს ტიპისგან. G, H. PC2 და PC1 დრაივერებს შორის კორელაციები ტრანსკრიპტომებსა და პროტეომებში.
მოულოდნელად, MYH-ზე დაფუძნებული მიოფიბრის ტიპი ხსნიდა ცვალებადობის მხოლოდ მეორე ყველაზე მაღალ ხარისხს (PC2), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ MYH-ზე დაფუძნებული მიოფიბრის ტიპთან (PC1) დაუკავშირებელი სხვა ბიოლოგიური ფაქტორები მნიშვნელოვან როლს თამაშობენ ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის რეგულირებაში. PC1-ში მთავარი მამოძრავებელი ფაქტორების გადაჭარბებული წარმოდგენის ანალიზმა აჩვენა, რომ PC1-ში ცვალებადობა ძირითადად განისაზღვრებოდა უჯრედშორისი ადჰეზიით და რიბოსომის შემცველობით ტრანსკრიპტომში, და კოსტამერებითა და რიბოსომული ცილებით პროტეომაში (სურათი 2B და დამატებითი სურათები 6D–E, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 7). ჩონჩხის კუნთში კოსტამერები აკავშირებენ Z-დისკს სარკოლემასთან და მონაწილეობენ ძალის გადაცემასა და სიგნალიზაციაში. 25 ანოტირებულმა PCA დიაგრამებმა, რომლებიც იყენებდნენ უჯრედშორისი ადჰეზიის (ტრანსკრიპტომი, სურათი 2C) და კოსტამერის (პროტეომი, სურათი 2D) მახასიათებლებს, გამოავლინა PC1-ში ძლიერი მარცხნივ გადახრა, რაც მიუთითებს, რომ ეს მახასიათებლები გამდიდრებულია გარკვეულ ბოჭკოებში.
მიოფიბერების კლასტერიზაციის UMAP დონეზე უფრო დეტალურმა შესწავლამ აჩვენა, რომ მახასიათებლების უმეტესობა ავლენდა მიოფიბერის ტიპისგან დამოუკიდებელ MYH-ზე დაფუძნებულ ექსპრესიის გრადიენტს და არა მიოფიბერის ქვეკლასტერზე სპეციფიკურს. ეს უწყვეტობა დაფიქსირდა პათოლოგიურ მდგომარეობებთან ასოცირებულ რამდენიმე გენში (სურათი 2E), როგორიცაა CHCHD10 (ნერვკუნთოვანი დაავადება), SLIT3 (კუნთების ატროფია), CTDNEP1 (კუნთების დაავადება). ეს უწყვეტობა ასევე დაფიქსირდა პროტეომაში, მათ შორის ნევროლოგიურ დარღვევებთან (UGDH), ინსულინის სიგნალიზაციასთან (PHIP) და ტრანსკრიფციასთან ასოცირებულ ცილებში (HIST1H2AB) (სურათი 2F). ერთობლივად, ეს მონაცემები მიუთითებს ბოჭკოების ტიპისგან დამოუკიდებელ ნელი/სწრაფი შეკუმშვის ჰეტეროგენულობაში უწყვეტობაზე სხვადასხვა მიოფიბერში.
საინტერესოა, რომ PC2-ში მძღოლმა გენებმა კარგი ტრანსკრიპტომ-პროტეომის კორელაცია აჩვენეს (r = 0.663) (სურათი 2G), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ნელა და სწრაფად შეკუმშვადი ბოჭკოების ტიპები, კერძოდ, ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების შეკუმშვადი და მეტაბოლური თვისებები, ტრანსკრიფციულად რეგულირდება. თუმცა, PC1-ში მძღოლმა გენებმა არ აჩვენეს ტრანსკრიპტომ-პროტეომის კორელაცია (r = -0.027) (სურათი 2H), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ნელა/სწრაფად შეკუმშვადი ბოჭკოების ტიპებთან დაუკავშირებელი ვარიაციები დიდწილად რეგულირდება ტრანსკრიფციის შემდეგ. რადგან PC1-ში ვარიაციები ძირითადად რიბოსომული გენის ონტოლოგიური ტერმინებით აიხსნებოდა და იმის გათვალისწინებით, რომ რიბოსომები უჯრედში გადამწყვეტ და სპეციალიზებულ როლს ასრულებენ ცილის ტრანსლაციაში აქტიური მონაწილეობით და მასზე გავლენის მოხდენით,31 ჩვენ შემდეგ დავიწყეთ ამ მოულოდნელი რიბოსომული ჰეტეროგენულობის შესწავლა.
თავდაპირველად, პროტეომიკის მთავარი კომპონენტის ანალიზის დიაგრამა შევღებეთ GOCC ტერმინში „ციტოპლაზმური რიბოსომა“ ცილების ფარდობითი სიმრავლის მიხედვით (სურათი 3A). მიუხედავად იმისა, რომ ეს ტერმინი გამდიდრებულია PC1-ის დადებით მხარესთან, რაც იწვევს მცირე გრადიენტს, რიბოსომული ცილები განაპირობებენ PC1-ის ორივე მიმართულებით დაყოფას (სურათი 3A). PC1-ის უარყოფით მხარეს გამდიდრებული რიბოსომული ცილები მოიცავდა RPL18-ს, RPS18-ს და RPS13-ს (სურათი 3B), ხოლო RPL31, RPL35 და RPL38 (სურათი 3C) იყო PC1-ის დადებით მხარეს მთავარი მამოძრავებელი ძალა. საინტერესოა, რომ RPL38 და RPS13 სხვა ქსოვილებთან შედარებით ჩონჩხის კუნთში მაღალ დონეზე იყო გამოხატული (დამატებითი სურათი 7A). PC1-ში ეს გამორჩეული რიბოსომული ხელმოწერები არ დაფიქსირებულა ტრანსკრიპტომში (დამატებითი სურათი 7B), რაც მიუთითებს ტრანსკრიფციის შემდგომ რეგულაციაზე.
A. პროტეომაში ციტოპლაზმური რიბოსომული გენის ონტოლოგიის (GO) ტერმინების მიხედვით შეფერილი მთავარი კომპონენტის ანალიზის (PCA) დიაგრამა. ისრები PCA დიაგრამაში ცილით განპირობებული ვარიაციის მიმართულებას მიუთითებს. ხაზის სიგრძე შეესაბამება მოცემული ცილის მთავარი კომპონენტის ქულას. B, C. RPS13-ისა და RPL38-ის PCA მახასიათებლების დიაგრამები. D. ციტოპლაზმური რიბოსომული ცილების იერარქიული კლასტერიზაციის უკონტროლო ანალიზი. E. 80S რიბოსომის სტრუქტურული მოდელი (PDB: 4V6X), რომელიც გამოყოფს რიბოსომურ ცილებს ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში სხვადასხვა სიმრავლით. F. mRNA-ს გამოსასვლელი არხის მახლობლად ლოკალიზებული სხვადასხვა სტექიომეტრიის მქონე რიბოსომული ცილები.
რიბოსომული ჰეტეროგენულობისა და სპეციალიზაციის კონცეფციები ადრეც იყო შემოთავაზებული, სადაც განსხვავებული რიბოსომული სუბპოპულაციების არსებობას (რიბოსომული ჰეტეროგენულობა) შეუძლია პირდაპირ გავლენა მოახდინოს ცილის ტრანსლაციაზე სხვადასხვა ქსოვილებსა და უჯრედებში32 და უჯრედებში33 სპეციფიკური mRNA ტრანსკრიპტის პულების შერჩევითი ტრანსლაციის გზით34 (რიბოსომული სპეციალიზაცია). ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში თანაექსპრესირებული რიბოსომული ცილების სუბპოპულაციების იდენტიფიცირებისთვის, ჩვენ ჩავატარეთ რიბოსომული ცილების უკონტროლო იერარქიული კლასტერიზაციის ანალიზი პროტეომაში (სურათი 3D, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 8). როგორც მოსალოდნელი იყო, რიბოსომული ცილები არ კლასტერდებოდა ბოჭკოს ტიპის მიხედვით MYH-ის მიხედვით. თუმცა, ჩვენ გამოვავლინეთ რიბოსომული ცილების სამი განსხვავებული კლასტერი; პირველი კლასტერი (რიბოსომული_კლასტერი_1) კორეგულირდება RPL38-ით და შესაბამისად, მისი ექსპრესია გაზრდილია ბოჭკოებში დადებითი PC1 პროფილით. მეორე კლასტერი (რიბოსომული_კლასტერი_2) კორეგულირდება RPS13-ით და მომატებულია ბოჭკოებში უარყოფითი PC1 პროფილით. მესამე კლასტერი (ribosomal_cluster_3) არ ავლენს კოორდინირებულ დიფერენციალურ ექსპრესიას ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში და შეიძლება ჩაითვალოს ჩონჩხის კუნთების რიბოსომული ცილის „ძირითად“ ფორმებად. ორივე რიბოსომული კლასტერი, 1 და 2, შეიცავს რიბოსომურ ცილებს, რომლებიც ადრე დადასტურებულად არეგულირებენ ალტერნატიულ ტრანსლაციას (მაგ., RPL10A, RPL38, RPS19 და RPS25) და ფუნქციურად ახდენენ გავლენას განვითარებაზე (მაგ., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA შედეგებთან შესაბამისობაში, ამ რიბოსომული ცილების დაკვირვებულმა ჰეტეროგენულმა წარმომადგენლობამ ბოჭკოებს შორის ასევე აჩვენა უწყვეტობა (დამატებითი სურათი 7C).
რიბოსომაში ჰეტეროგენული რიბოსომული ცილების მდებარეობის ვიზუალიზაციისთვის, ჩვენ გამოვიყენეთ ადამიანის 80S რიბოსომის სტრუქტურული მოდელი (პროტეინის მონაცემთა ბანკი: 4V6X) (სურათი 3E). სხვადასხვა რიბოსომული კლასტერების კუთვნილი რიბოსომული ცილების იზოლირების შემდეგ, მათი მდებარეობა მჭიდროდ არ იყო განლაგებული, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ჩვენი მიდგომა ვერ უზრუნველყოფდა რიბოსომის გარკვეული რეგიონების/ფრაქციების გამდიდრებას. საინტერესოა, რომ კლასტერ 2-ში დიდი ქვედანაყოფის ცილების პროპორცია უფრო დაბალი იყო, ვიდრე კლასტერ 1-სა და 3-ში (დამატებითი სურათი 7D). ჩვენ დავაკვირდით, რომ ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში შეცვლილი სტექიომეტრიის მქონე ცილები უპირატესად ლოკალიზებული იყო რიბოსომის ზედაპირზე (სურათი 3E), რაც შეესაბამება მათ უნარს, ურთიერთქმედებდნენ შიდა რიბოსომის შესვლის ადგილის (IRES) ელემენტებთან სხვადასხვა mRNA პოპულაციებში, რითაც კოორდინაციას უწევდნენ შერჩევით ტრანსლაციას.40, 41 გარდა ამისა, ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში შეცვლილი სტექიომეტრიის მქონე მრავალი ცილა მდებარეობდა ფუნქციურ რეგიონებთან ახლოს, როგორიცაა mRNA-ს გასასვლელი გვირაბი (სურათი 3F), რომლებიც შერჩევით არეგულირებენ ტრანსლაციურ დაგრძელებას და სპეციფიკური პეპტიდების შეჩერებას. 42 შეჯამებისთვის, ჩვენი მონაცემები მიუთითებს, რომ ჩონჩხის კუნთების რიბოსომული ცილების სტექიომეტრია ავლენს ჰეტეროგენულობას, რაც იწვევს განსხვავებებს ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებს შორის.
შემდეგ ჩვენ დავიწყეთ სწრაფი და ნელა შეკუმშვადი ბოჭკოების ხელმოწერების იდენტიფიცირება და მათი ტრანსკრიფციული რეგულირების მექანიზმების შესწავლა. ორ მონაცემთა ნაკრებში (სურათები 1G–H და 4A–B) UMAP-ის მიერ განსაზღვრული სწრაფი და ნელა შეკუმშვადი ბოჭკოების კლასტერების შედარების შედეგად, ტრანსკრიპტომიულმა და პროტეომიკურმა ანალიზებმა გამოავლინა შესაბამისად 1366 და 804 დიფერენციალურად უხვი მახასიათებელი (სურათები 4A–B, დამატებითი მონაცემთა ნაკრებები 9–12). ჩვენ დავაკვირდით სარკომერებთან (მაგ., ტროპომიოზინი და ტროპონინი), აგზნება-შეკუმშვის შეერთებასთან (SERCA იზოფორმები) და ენერგიის მეტაბოლიზმთან (მაგ., ALDOA და CKB) დაკავშირებული ხელმოწერების მოსალოდნელ განსხვავებებს. გარდა ამისა, ტრანსკრიპტები და ცილები, რომლებიც არეგულირებენ ცილის უბიკვიტინაციებს, დიფერენციალურად იყო გამოხატული სწრაფი და ნელა შეკუმშვადი ბოჭკოებში (მაგ., USP54, SH3RF2, USP28 და USP48) (სურათები 4A–B). გარდა ამისა, მიკრობული ცილის გენი RP11-451G4.2 (DWORF), რომელიც ადრე, როგორც აღმოჩნდა, დიფერენცირებულად არის გამოხატული ცხვრის კუნთოვანი ბოჭკოების ტიპებში43 და აძლიერებს SERCA აქტივობას გულის კუნთში44, მნიშვნელოვნად მომატებული იყო ჩონჩხის ნელ კუნთოვან ბოჭკოებში (სურათი 4A). ანალოგიურად, ინდივიდუალური ბოჭკოების დონეზე, მნიშვნელოვანი განსხვავებები დაფიქსირდა ცნობილ ხელმოწერებში, როგორიცაა მეტაბოლიზმთან დაკავშირებული ლაქტატდეჰიდროგენაზას იზოფორმები (LDHA და LDHB, სურათი 4C და დამატებითი სურათი 8A)45,46, ასევე აქამდე უცნობი ბოჭკოების ტიპის სპეციფიკური ხელმოწერები (როგორიცაა IRX3, USP54, USP28 და DPYSL3) (სურათი 4C). ტრანსკრიპტომიულ და პროტეომიკურ მონაცემთა ნაკრებებს შორის დიფერენცირებულად გამოხატული მახასიათებლების მნიშვნელოვანი გადაფარვა იყო (დამატებითი სურათი 8B), ასევე ნაკეცის ცვლილების კორელაცია, რომელიც ძირითადად განპირობებული იყო სარკომერის მახასიათებლების უფრო გამოხატული დიფერენციალური ექსპრესიით (დამატებითი სურათი 8C). აღსანიშნავია, რომ ზოგიერთმა ხელმოწერამ (მაგ. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) აჩვენა ძლიერი პოსტტრანსკრიფციული რეგულირება მხოლოდ პროტეომიკურ დონეზე და გააჩნდა ნელი/სწრაფი შეკუმშვის ბოჭკოების ტიპ-სპეციფიკური ექსპრესიის პროფილები (დამატებითი სურათი 8C).
A და B ვულკანური დიაგრამები, რომლებიც ადარებენ ნელ და სწრაფ კლასტერებს, რომლებიც იდენტიფიცირებულია ერთგვაროვანი მანიფოლდური აპროქსიმაციისა და პროექციის (UMAP) დიაგრამებით ნახაზებში 1G–H. ფერადი წერტილები წარმოადგენს ტრანსკრიპტებს ან ცილებს, რომლებიც მნიშვნელოვნად განსხვავდება FDR < 0.05-ზე, ხოლო უფრო მუქი წერტილები წარმოადგენს ტრანსკრიპტებს ან ცილებს, რომლებიც მნიშვნელოვნად განსხვავდება ლოგარითმული ცვლილების > 1-ზე. ორმხრივი სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა DESeq2 Wald ტესტის გამოყენებით ბენჯამინი-ჰოხბერგის მიერ კორექტირებული p მნიშვნელობებით (ტრანსკრიპტომიკა) ან Limma-ს ხაზოვანი მოდელის მეთოდით ემპირიული ბაიესის ანალიზით, რასაც მოჰყვა ბენჯამინი-ჰოხბერგის კორექტირება მრავალჯერადი შედარებებისთვის (პროტეომიკა). C შერჩეული დიფერენცირებულად ექსპრესირებული გენების ან ცილების ხელმოწერის დიაგრამები ნელ და სწრაფ ბოჭკოებს შორის. D მნიშვნელოვნად დიფერენცირებულად ექსპრესირებული ტრანსკრიპტებისა და ცილების გამდიდრების ანალიზი. გადაფარვის მნიშვნელობები გამდიდრებულია ორივე მონაცემთა ნაკრებში, ტრანსკრიპტომის მნიშვნელობები გამდიდრებულია მხოლოდ ტრანსკრიპტომში, ხოლო პროტეომის მნიშვნელობები გამდიდრებულია მხოლოდ პროტეომაში. სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა clusterProfiler პაკეტის გამოყენებით ბენჯამინი-ჰოხბერგის მიერ კორექტირებული p-მნიშვნელობებით. E. ბოჭკოების ტიპ-სპეციფიკური ტრანსკრიფციის ფაქტორები, რომლებიც იდენტიფიცირებულია SCENIC-ის მიერ SCENIC-ის მიერ მიღებული რეგულატორის სპეციფიკურობის ქულებისა და ბოჭკოების ტიპებს შორის დიფერენციალური mRNA ექსპრესიის საფუძველზე. F. ნელ და სწრაფ ბოჭკოებს შორის დიფერენციალურად ექსპრესირებული შერჩეული ტრანსკრიფციის ფაქტორების პროფილირება.
შემდეგ ჩვენ ჩავატარეთ დიფერენცირებულად წარმოდგენილი გენებისა და ცილების ზედმეტად წარმოდგენის ანალიზი (სურათი 4D, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 13). ორ მონაცემთა ნაკრებში განსხვავებული მახასიათებლების გზების გამდიდრებამ გამოავლინა მოსალოდნელი განსხვავებები, როგორიცაა ცხიმოვანი მჟავების β-დაჟანგვა და კეტონის მეტაბოლიზმის პროცესები (ნელი ბოჭკოები), მიოფილამენტის/კუნთების შეკუმშვა (შესაბამისად, სწრაფი და ნელი ბოჭკოები) და ნახშირწყლების კატაბოლური პროცესები (სწრაფი ბოჭკოები). სერინ/თრეონინ ცილა ფოსფატაზას აქტივობა ასევე მომატებული იყო სწრაფ ბოჭკოებში, რაც განპირობებული იყო ისეთი მახასიათებლებით, როგორიცაა მარეგულირებელი და კატალიზური ფოსფატაზას ქვეერთეულები (PPP3CB, PPP1R3D და PPP1R3A), რომლებიც ცნობილია გლიკოგენის მეტაბოლიზმის რეგულირებით (47) (დამატებითი ფიგურები 8D–E). სწრაფი ბოჭკოებით გამდიდრებული სხვა გზები მოიცავდა პროტეომაში (დამატებითი სურ. 8F) დამუშავების (P-) სხეულებს (YTHDF3, TRIM21, LSM2), რომლებიც პოტენციურად მონაწილეობენ ტრანსკრიფციის შემდგომ რეგულაციაში (48) და ტრანსკრიფციის ფაქტორის აქტივობას (SREBF1, RXRG, RORA) ტრანსკრიპტომში (დამატებითი სურ. 8G). ნელი ბოჭკოები გამდიდრებული იყო ოქსიდორედუქტაზას აქტივობით (BDH1, DCXR, TXN2) (დამატებითი სურ. 8H), ამიდის შეკავშირებით (CPTP, PFDN2, CRYAB) (დამატებითი სურ. 8I), უჯრედგარე მატრიქსით (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (დამატებითი სურ. 8J) და რეცეპტორ-ლიგანდის აქტივობით (FNDC5, SPX, NENF) (დამატებითი სურ. 8K).
ნელი/სწრაფი კუნთოვანი ბოჭკოების ტიპის მახასიათებლების საფუძვლად მყოფი ტრანსკრიფციული რეგულირების შესახებ დამატებითი ინფორმაციის მისაღებად, ჩვენ ჩავატარეთ ტრანსკრიფციის ფაქტორების გამდიდრების ანალიზი SCENIC49-ის გამოყენებით (დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 14). სწრაფ და ნელ კუნთოვან ბოჭკოებს შორის ტრანსკრიფციის მრავალი ფაქტორი მნიშვნელოვნად გამდიდრებული იყო (სურათი 4E). ეს მოიცავდა ტრანსკრიფციის ფაქტორებს, როგორიცაა MAFA, რომელიც ადრე დაკავშირებული იყო კუნთოვანი ბოჭკოების სწრაფ განვითარებასთან,50 ასევე რამდენიმე ტრანსკრიფციის ფაქტორს, რომლებიც ადრე არ იყო დაკავშირებული კუნთოვანი ბოჭკოების ტიპის სპეციფიკურ გენის პროგრამებთან. მათ შორის, PITX1, EGR1 და MYF6 იყო ყველაზე გამდიდრებული ტრანსკრიფციის ფაქტორები სწრაფ კუნთოვან ბოჭკოებში (სურათი 4E). ამის საპირისპიროდ, ZSCAN30 და EPAS1 (ასევე ცნობილი როგორც HIF2A) იყო ყველაზე გამდიდრებული ტრანსკრიფციის ფაქტორები ნელ კუნთოვან ბოჭკოებში (სურათი 4E). ამასთან შესაბამისობაში, MAFA უფრო მაღალ დონეზე იყო გამოხატული UMAP რეგიონში, რომელიც შეესაბამება სწრაფ კუნთოვან ბოჭკოებს, ხოლო EPAS1-ს ჰქონდა საპირისპირო ექსპრესიის ნიმუში (სურათი 4F).
ცნობილი ცილის კოდირების გენების გარდა, არსებობს მრავალი არაკოდირებადი რნმ ბიოტიპი, რომლებიც შეიძლება მონაწილეობდნენ ადამიანის განვითარებისა და დაავადებების რეგულირებაში.51, 52 ტრანსკრიპტომის მონაცემთა ნაკრებებში, რამდენიმე არაკოდირებადი რნმ ავლენს ბოჭკოების ტიპის სპეციფიკურობას (სურათი 5A და დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 15), მათ შორის LINC01405, რომელიც მაღალსპეციფიკურია ნელი ბოჭკოებისთვის და, როგორც აღნიშნულია, შემცირებულია კუნთებში მიტოქონდრიული მიოპათიის მქონე პაციენტებში.53 ამის საპირისპიროდ, RP11-255P5.3, რომელიც შეესაბამება lnc-ERCC5-5 გენს (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, ავლენს სწრაფი ბოჭკოების ტიპის სპეციფიკურობას. როგორც LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), ასევე RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) ავლენენ ჩონჩხის კუნთების სპეციფიკურობას (დამატებითი სურათებში 9A–B) და არ აქვთ ცნობილი შეკუმშვის გენები მათ 1 მბ გენომურ სამეზობლოში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ისინი სპეციალიზებულ როლს ასრულებენ ბოჭკოების ტიპების რეგულირებაში და არა მეზობელი შეკუმშვის გენების რეგულირებაში. LINC01405-ის და RP11-255P5.3-ის ნელი/სწრაფი ბოჭკოების ტიპ-სპეციფიკური ექსპრესიის პროფილები, შესაბამისად, დადასტურდა RNAscope-ის გამოყენებით (სურათები 5B–C).
ა. არაკოდირებული რნმ ტრანსკრიპტები მნიშვნელოვნად რეგულირდება ნელა და სწრაფად შეკუმშვად კუნთოვან ბოჭკოებში. ბ. წარმომადგენლობითი რნმოსკოპის გამოსახულებები, რომლებიც აჩვენებს შესაბამისად LINC01405 და RP11-255P5.3 ნელა და სწრაფად შეკუმშვად ბოჭკოების ტიპის სპეციფიკურობას. შკალის ზოლი = 50 μm. გ. მიოფიბერის ტიპის სპეციფიკური არაკოდირებული რნმ ექსპრესიის რაოდენობრივი განსაზღვრა, როგორც ეს განსაზღვრულია RNAscope-ით (n = 3 ბიოფსია დამოუკიდებელი ინდივიდებისგან, თითოეულ ინდივიდში სწრაფი და ნელი კუნთოვანი ბოჭკოების შედარება). სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტის გამოყენებით. ჩარჩოების დიაგრამები აჩვენებს მედიანას და პირველ და მესამე კვარტილებს, ულვაშებით, რომლებიც მიუთითებს მინიმალურ და მაქსიმალურ მნიშვნელობებზე. დ. მიკრობული ცილის de novo იდენტიფიკაციის სამუშაო პროცესი (შექმნილია BioRender.com-ით). ე. მიკრობული ცილა LINC01405_ORF408:17441:17358 სპეციფიკურად არის გამოხატული ჩონჩხის ნელ კუნთოვან ბოჭკოებში (n = 5 ბიოფსია დამოუკიდებელი მონაწილეებისგან, თითოეულ მონაწილეში სწრაფი და ნელი კუნთოვანი ბოჭკოების შედარება). სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა ლიმის წრფივი მოდელის მეთოდის გამოყენებით ემპირიულ ბაიესისეულ მიდგომასთან ერთად, რასაც მოჰყვა ბენჯამინი-ჰოხბერგის მეთოდი p-მნიშვნელობის კორექტირებით მრავალჯერადი შედარებისთვის. ჩარჩო დიაგრამები აჩვენებს მედიანას, პირველ და მესამე კვარტილებს, ულვაშებით, რომლებიც მიუთითებს მაქსიმალურ/მინიმალურ მნიშვნელობებზე.
ბოლო დროს ჩატარებულმა კვლევებმა აჩვენა, რომ მრავალი სავარაუდო არაკოდირებადი ტრანსკრიპტი აკოდირებს ტრანსკრიფცირებულ მიკრობულ ცილებს, რომელთაგან ზოგიერთი არეგულირებს კუნთების ფუნქციას.44, 55 პოტენციური ბოჭკოვანი ტიპის სპეციფიკურობის მქონე მიკრობული ცილების იდენტიფიცირებისთვის, ჩვენ მოვიძიეთ ჩვენი 1000 ბოჭკოვანი პროტეომის მონაცემთა ნაკრები მორგებული FASTA ფაილის გამოყენებით, რომელიც შეიცავს 1000 ბოჭკოვანი ტრანსკრიპტომის მონაცემთა ნაკრებში ნაპოვნი არაკოდირებადი ტრანსკრიპტების (n = 305) თანმიმდევრობებს (სურათი 5D). ჩვენ აღმოვაჩინეთ 197 მიკრობული ცილა 22 სხვადასხვა ტრანსკრიპტიდან, რომელთაგან 71 დიფერენცირებულად რეგულირდებოდა ნელ და სწრაფ ჩონჩხის კუნთოვან ბოჭკოებს შორის (დამატებითი სურათი 9C და დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 16). LINC01405-ისთვის იდენტიფიცირებული იქნა სამი მიკრობული ცილოვანი პროდუქტი, რომელთაგან ერთ-ერთმა აჩვენა ნელი ბოჭკოების მსგავსი სპეციფიკურობა მის ტრანსკრიპტთან შედარებით (სურათი 5E და დამატებითი სურათი 9D). ამრიგად, ჩვენ აღმოვაჩინეთ LINC01405, როგორც გენი, რომელიც აკოდირებს ნელი ჩონჩხის კუნთოვანი ბოჭკოებისთვის სპეციფიკურ მიკრობულ ცილას.
ჩვენ შევიმუშავეთ ყოვლისმომცველი სამუშაო პროცესი ცალკეული კუნთოვანი ბოჭკოების ფართომასშტაბიანი პროტეომიკური დახასიათებისთვის და ჯანმრთელ მდგომარეობაში ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის რეგულატორები გამოვავლინეთ. ჩვენ გამოვიყენეთ ეს სამუშაო პროცესი იმის გასაგებად, თუ როგორ მოქმედებს ნემალინის მიოპათიები ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ჰეტეროგენულობაზე. ნემალინის მიოპათიები მემკვიდრეობითი კუნთების დაავადებებია, რომლებიც იწვევს კუნთების სისუსტეს და დაავადებულ ბავშვებში ვლინდება გართულებების ფართო სპექტრით, მათ შორის სუნთქვის დისტრესი, სქოლიოზი და კიდურების შეზღუდული მობილურობა.19,20 როგორც წესი, ნემალინის მიოპათიების დროს, ისეთი გენების პათოგენური ვარიანტები, როგორიცაა აქტინ ალფა 1 (ACTA1), იწვევს ნელა შეკუმშვადი ბოჭკოების მიოფიბრის შემადგენლობის უპირატესობას, თუმცა ეს ეფექტი ჰეტეროგენულია. ერთი აღსანიშნავი გამონაკლისია ტროპონინ T1 ნემალინის მიოპათია (TNNT1), რომელშიც ჭარბობს სწრაფი ბოჭკოები. ამრიგად, ნემალინის მიოპათიებში დაფიქსირებული ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების დისრეგულაციის საფუძვლად არსებული ჰეტეროგენულობის უკეთ გაგებამ შეიძლება ხელი შეუწყოს ამ დაავადებებსა და მიოფიბრის ტიპს შორის რთული ურთიერთობის ამოხსნას.
ჯანმრთელ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით (n = 3 ჯგუფში), ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებიდან იზოლირებულ მიოფიბრებს, რომლებსაც ACTA1 და TNNT1 გენებში მუტაციები ჰქონდათ, აღენიშნებოდათ მიოფიბრის გამოხატული ატროფია ან დისტროფია (სურათი 6A, დამატებითი ცხრილი 3). ეს წარმოადგენდა მნიშვნელოვან ტექნიკურ სირთულეებს პროტეომიკური ანალიზისთვის ხელმისაწვდომი მასალის შეზღუდული რაოდენობის გამო. ამის მიუხედავად, ჩვენ შევძელით 272 ჩონჩხის მიოფიბრაში 2485 ცილის აღმოჩენა. ბოჭკოზე მინიმუმ 1000 რაოდენობრივად განსაზღვრული ცილის ფილტრაციის შემდეგ, 250 ბოჭკო დაექვემდებარა შემდგომ ბიოინფორმატიკულ ანალიზს. ფილტრაციის შემდეგ, ბოჭკოზე საშუალოდ 1573 ± 359 ცილა რაოდენობრივად განისაზღვრა (დამატებითი სურათი 10A, დამატებითი მონაცემთა ნაკრებები 17–18). აღსანიშნავია, რომ ბოჭკოების ზომის მნიშვნელოვანი შემცირების მიუხედავად, ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტების ნიმუშების პროტეომის სიღრმე მხოლოდ ზომიერად შემცირდა. გარდა ამისა, ამ მონაცემების ჩვენივე FASTA ფაილების გამოყენებით (მათ შორის არაკოდირებული ტრანსკრიპტების) დამუშავებამ საშუალება მოგვცა ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტების ჩონჩხის მიოფიბრებში ხუთი მიკრობული ცილა გამოგვევლინა (დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 19). პროტეომის დინამიური დიაპაზონი მნიშვნელოვნად ფართო იყო და საკონტროლო ჯგუფში ცილების საერთო რაოდენობა კარგად კორელირებდა წინა 1000-ბოჭკოვანი პროტეომის ანალიზის შედეგებთან (დამატებითი სურ. 10B–C).
ა. მიკროსკოპული გამოსახულებები, რომლებიც აჩვენებენ ბოჭკოების ატროფიას ან დისტროფიას და სხვადასხვა ტიპის ბოჭკოების უპირატესობას MYH-ის მიხედვით ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიებში (NM). შკალის ზოლი = 100 μm. ACTA1 და TNNT1 პაციენტებში შეღებვის რეპროდუცირებადობის უზრუნველსაყოფად, სამი პაციენტის ბიოფსია შეღებილი იქნა ორ-სამჯერ (ოთხი სექცია თითო შემთხვევაში) წარმომადგენლობითი გამოსახულებების შერჩევამდე. ბ. მონაწილეებში ბოჭკოების ტიპის პროპორციები MYH-ის მიხედვით. გ. ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების მთავარი კომპონენტის ანალიზის (PCA) დიაგრამა ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებში და საკონტროლო ჯგუფში. დ. ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებისა და საკონტროლო ჯგუფის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოები პროეცირებულია PCA დიაგრამაზე, რომელიც განისაზღვრა ნახაზ 2-ში გაანალიზებული 1000 ბოჭკოდან. მაგალითად, ვულკანის დიაგრამები, რომლებიც ადარებენ განსხვავებებს ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე მონაწილეებსა და საკონტროლო ჯგუფს შორის, ასევე ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე მონაწილეებს შორის. ფერადი წრეები აღნიშნავს ცილებს, რომლებიც მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდა π < 0.05-ზე, ხოლო მუქი წერტილები აღნიშნავს ცილებს, რომლებიც მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდა FDR < 0.05-ზე. სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა ლიმას წრფივი მოდელის მეთოდისა და ემპირიული ბაიესის მეთოდების გამოყენებით, რასაც მოჰყვა p-მნიშვნელობის კორექტირება მრავალჯერადი შედარებებისთვის ბენჯამინი-ჰოხბერგის მეთოდის გამოყენებით. H. მნიშვნელოვნად დიფერენცირებულად ექსპრესირებული ცილების გამდიდრების ანალიზი მთელ პროტეომაზე და 1 და 2A ტიპის ბოჭკოებში. სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა clusterProfiler პაკეტისა და ბენჯამინი-ჰოხბერგის კორექტირებული p-მნიშვნელობების გამოყენებით. I, J. ძირითადი კომპონენტის ანალიზის (PCA) დიაგრამები, რომლებიც შეფერილია უჯრედგარე მატრიქსისა და მიტოქონდრიული გენის ონტოლოგიის (GO) ტერმინებით.
რადგან ნემალინის მიოპათიებს შეუძლიათ გავლენა მოახდინონ ჩონჩხის კუნთში MYH-გამომხატველი მიოფიბერის ტიპების პროპორციაზე,19,20 ჩვენ თავდაპირველად შევისწავლეთ MYH-გამომხატველი მიოფიბერის ტიპები ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებში და საკონტროლო ჯგუფში. ჩვენ განვსაზღვრეთ მიოფიბერის ტიპი 1000 მიოფიბერის ანალიზისთვის ადრე აღწერილი მიუკერძოებელი მეთოდის გამოყენებით (დამატებითი სურ. 10D–E) და კვლავ ვერ შევძელით სუფთა 2X მიოფიბერების იდენტიფიცირება (სურათი 6B). ჩვენ დავაკვირდით ნემალინის მიოპათიების ჰეტეროგენულ ეფექტს მიოფიბერის ტიპზე, რადგან ACTA1 მუტაციების მქონე ორ პაციენტს ჰქონდა 1 ტიპის მიოფიბერების გაზრდილი პროპორცია, მაშინ როდესაც TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე ორ პაციენტს ჰქონდა 1 ტიპის მიოფიბერების შემცირებული პროპორცია (სურათი 6B). მართლაც, MYH2-ის და სწრაფი ტროპონინის იზოფორმების (TNNC2, TNNI2 და TNNT3) ექსპრესია შემცირებული იყო ACTA1-ნემალინის მიოპათიების დროს, მაშინ როდესაც MYH7 ექსპრესია შემცირებული იყო TNNT1-ნემალინის მიოპათიების დროს (დამატებითი სურათი 11A). ეს თანხვედრაშია ნემალინის მიოპათიების დროს მიოფიბრის ტიპის ჰეტეროგენული გადართვის შესახებ ადრე გავრცელებულ ცნობებთან.19,20 ჩვენ ეს შედეგები იმუნოჰისტოქიმიით დავადასტურეთ და აღმოვაჩინეთ, რომ ACTA1-ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებში ჭარბობდა 1 ტიპის მიოფიბრი, მაშინ როდესაც TNNT1-ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებში საპირისპირო სურათი იყო (სურათი 6A).
ერთბოჭკოვანი პროტეომის დონეზე, ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტების ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოები კონცენტრირებული იყო საკონტროლო ბოჭკოების უმრავლესობასთან, სადაც TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტები, როგორც წესი, ყველაზე მძიმედ ზიანდებოდნენ (სურათი 6C). ეს განსაკუთრებით აშკარა იყო თითოეული პაციენტისთვის ფსევდოგაბერილი ბოჭკოების მთავარი კომპონენტის ანალიზის (PCA) დიაგრამების აგებისას, სადაც TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტები 2 და 3 ყველაზე დაშორებულნი ჩანდნენ საკონტროლო ნიმუშებიდან (დამატებითი სურათი 11B, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 20). იმის უკეთ გასაგებად, თუ როგორ შეედრება მიოპათიის მქონე პაციენტების ბოჭკოები ჯანმრთელ ბოჭკოებს, ჩვენ გამოვიყენეთ დეტალური ინფორმაცია, რომელიც მიღებული იყო ჯანმრთელი ზრდასრული მონაწილეების 1000 ბოჭკოს პროტეომიკური ანალიზიდან. ჩვენ პროეცირებული გვქონდა მიოპათიის მონაცემთა ნაკრებიდან (ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტები და საკონტროლო ჯგუფი) ბოჭკოები 1000-ბოჭკოვანი პროტეომიკური ანალიზიდან მიღებულ PCA დიაგრამაზე (სურათი 6D). საკონტროლო ბოჭკოებში PC2-ის გასწვრივ MYH ბოჭკოების ტიპების განაწილება მსგავსი იყო 1000-ბოჭკოვანი პროტეომიკური ანალიზით მიღებული ბოჭკოების განაწილებისა. თუმცა, ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებში ბოჭკოების უმეტესობა გადაადგილდა PC2-ის ქვემოთ, გადაფარვით ჯანმრთელ სწრაფად შეკუმშვად ბოჭკოებთან, მათი ბუნებრივი MYH ბოჭკოების ტიპის მიუხედავად. ამრიგად, მიუხედავად იმისა, რომ ACTA1 ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებში MYH-ზე დაფუძნებული მეთოდების გამოყენებით რაოდენობრივი შეფასებისას, მათ აჩვენეს გადასვლა 1 ტიპის ბოჭკოებისკენ, როგორც ACTA1 ნემალინის მიოპათიამ, ასევე TNNT1 ნემალინის მიოპათიამ ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების პროტეომა გადაიტანა სწრაფად შეკუმშვადი ბოჭკოებისკენ.
შემდეგ ჩვენ პირდაპირ შევადარეთ თითოეული პაციენტთა ჯგუფი ჯანმრთელ საკონტროლო ჯგუფს და გამოვავლინეთ 256 და 552 დიფერენცირებულად ექსპრესირებული ცილა, შესაბამისად, ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიებში (სურათი 6E–G და დამატებითი სურათი 11C, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 21). გენის გამდიდრების ანალიზმა გამოავლინა მიტოქონდრიული ცილების კოორდინირებული შემცირება (სურათი 6H–I, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 22). გასაკვირია, რომ ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიებში ბოჭკოების ტიპების დიფერენციალური უპირატესობის მიუხედავად, ეს შემცირება სრულიად დამოუკიდებელი იყო MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოვანი ტიპისგან (სურათი 6H და დამატებითი სურათები 11D–I, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 23). სამი მიკრობული ცილა ასევე რეგულირდებოდა ACTA1 ან TNNT1 ნემალინის მიოპათიებში. ამ მიკროპროტეინებიდან ორმა, ENSG00000215483_TR14_ORF67-მა (ასევე ცნობილი როგორც LINC00598 ან Lnc-FOXO1) და ENSG00000229425_TR25_ORF40-მა (lnc-NRIP1-2), განსხვავებული სიმრავლე მხოლოდ 1 ტიპის მიოფიბრებში აჩვენა. ადრე იყო ცნობილი, რომ ENSG00000215483_TR14_ORF67-ს როლი აქვს უჯრედული ციკლის რეგულაციაში. 56 მეორეს მხრივ, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (შეესაბამება LINC01798-ს) გაზრდილი იყო როგორც 1, ასევე 2A ტიპის მიოფიბრებში ACTA1-ნემალინის მიოპათიის დროს ჯანმრთელ კონტროლთან შედარებით (დამატებითი სურათი 12A, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 24). ამის საპირისპიროდ, ნემალინის მიოპათია დიდწილად არ მოქმედებდა რიბოსომურ ცილებზე, თუმცა RPS17 დაქვეითებული იყო ACTA1 ნემალინის მიოპათიის დროს (სურ. 6E).
გამდიდრების ანალიზმა ასევე გამოავლინა იმუნური სისტემის პროცესების აქტივაცია ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიების დროს, ხოლო უჯრედების ადჰეზია ასევე გაიზარდა TNNT1 ნემალინის მიოპათიის დროს (სურათი 6H). ამ უჯრედგარე ფაქტორების გამდიდრება აისახა უჯრედგარე მატრიქსის ცილებით, რომლებიც PC1-სა და PC2-ში PCA-ს უარყოფითი მიმართულებით (ანუ ყველაზე დაზიანებული ბოჭკოებისკენ) გადაიტანდნენ (სურათი 6J). პაციენტთა ორივე ჯგუფმა აჩვენა იმუნურ პასუხებსა და სარკოლემის აღდგენის მექანიზმებში ჩართული უჯრედგარე ცილების, როგორიცაა ანექსინები (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 და მათი ურთიერთქმედების ცილა S100A1159 (დამატებითი სურათები 12B–C) გაზრდილი ექსპრესია. ადრე იყო ცნობილი, რომ ეს პროცესი გაძლიერებულია კუნთოვანი დისტროფიების დროს60, მაგრამ, ჩვენი ინფორმაციით, აქამდე არ იყო დაკავშირებული ნემალინის მიოპათიებთან. ამ მოლეკულური მექანიზმის ნორმალური ფუნქცია აუცილებელია დაზიანების შემდეგ სარკოლემის აღდგენისთვის და ახლად წარმოქმნილი მიოციტების მიოფიბრებთან შერწყმისთვის58,61. ამგვარად, ამ პროცესის გაზრდილი აქტივობა ორივე პაციენტთა ჯგუფში მიოფიბრის არასტაბილურობით გამოწვეულ დაზიანებაზე რეპარაციულ პასუხზე მიუთითებს.
თითოეული ნემალინის მიოპათიის ეფექტები კარგად იყო კორელირებული (r = 0.736) და აჩვენეს საკმაოდ დიდი გადაფარვა (დამატებითი სურათები 11A–B), რაც მიუთითებს, რომ ACTA1-ს და TNNT1 ნემალინის მიოპათიას მსგავსი ეფექტები აქვთ პროტეომაზე. თუმცა, ზოგიერთი ცილა რეგულირდებოდა მხოლოდ ACTA1 ან TNNT1 ნემალინის მიოპათიაში (დამატებითი სურათები 11A და C). პროფიბროზული ცილა MFAP4 იყო ერთ-ერთი ყველაზე მომატებული ცილა TNNT1 ნემალინის მიოპათიაში, მაგრამ უცვლელი დარჩა ACTA1 ნემალინის მიოპათიაში. SKIC8, PAF1C კომპლექსის კომპონენტი, რომელიც პასუხისმგებელია HOX გენის ტრანსკრიფციის რეგულირებაზე, დაქვეითებული იყო TNNT1 ნემალინის მიოპათიაში, მაგრამ არ იმოქმედა ACTA1 ნემალინის მიოპათიაზე (დამატებითი სურათ 11A). ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიის პირდაპირი შედარების შედეგად გამოვლინდა მიტოქონდრიული ცილების უფრო დიდი შემცირება და იმუნური სისტემის ცილების ზრდა TNNT1 ნემალინის მიოპათიის დროს (სურათი 6G–H და დამატებითი სურათები 11C და 11H–I). ეს მონაცემები შეესაბამება TNNT1 ნემალინის მიოპათიის დროს დაფიქსირებულ უფრო დიდ ატროფიას/დისტროფიას TNNT1 ნემალინის მიოპათიასთან შედარებით (სურათი 6A), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ TNNT1 ნემალინის მიოპათია დაავადების უფრო მძიმე ფორმას წარმოადგენს.
იმის შესაფასებლად, გრძელდება თუ არა ნემალინის მიოპათიის დაკვირვებული ეფექტები მთელ კუნთოვან დონეზე, ჩვენ ჩავატარეთ TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტების იმავე კოჰორტიდან აღებული კუნთების ბიოფსიების მასიური პროტეომიკური ანალიზი და შევადარეთ ისინი საკონტროლო ჯგუფს (n=3 ჯგუფში) (დამატებითი სურ. 13A, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 25). როგორც მოსალოდნელი იყო, საკონტროლო ჯგუფი მჭიდრო კავშირში იყო ძირითადი კომპონენტების ანალიზში, მაშინ როდესაც TNNT1 ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტებმა აჩვენეს უფრო მაღალი ნიმუშთაშორისი ცვალებადობა, მსგავსი იმისა, რაც დაფიქსირდა ცალკეული ბოჭკოების ანალიზში (დამატებითი სურ. 13B). მასობრივმა ანალიზმა წარმოადგინა დიფერენცირებულად ექსპრესირებული ცილები (დამატებითი სურ. 13C, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 26) და ბიოლოგიური პროცესები (დამატებითი სურ. 13D, დამატებითი მონაცემთა ნაკრები 27), რომლებიც გამოიკვეთა ინდივიდუალური ბოჭკოების შედარებით, მაგრამ დაკარგა სხვადასხვა ბოჭკოების ტიპებს შორის განსხვავების უნარი და ვერ გაითვალისწინა ბოჭკოებს შორის დაავადების ჰეტეროგენული ეფექტები.
ეს მონაცემები ერთად აჩვენებს, რომ ერთმიოფიბრიან პროტეომიკას შეუძლია გამოავლინოს კლინიკური ბიოლოგიური მახასიათებლები, რომელთა აღმოჩენა შეუძლებელია ისეთი მიზნობრივი მეთოდებით, როგორიცაა იმუნობლოტაცია. გარდა ამისა, ეს მონაცემები ხაზს უსვამს მხოლოდ აქტინის ბოჭკოების ტიპირების (MYH) გამოყენების შეზღუდვებს ფენოტიპური ადაპტაციის აღსაწერად. მართლაც, მიუხედავად იმისა, რომ ბოჭკოების ტიპის გადართვა განსხვავდება აქტინის და ტროპონინ ნემალინის მიოპათიებს შორის, ორივე ნემალინის მიოპათია MYH ბოჭკოების ტიპირებას ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების მეტაბოლიზმიდან უფრო სწრაფ და ნაკლებად ოქსიდაციურ კუნთოვან პროტეომაზე აკავშირებს.
უჯრედული ჰეტეროგენულობა კრიტიკულად მნიშვნელოვანია ქსოვილებისთვის, რათა დააკმაყოფილონ მათი მრავალფეროვანი მოთხოვნილებები. ჩონჩხის კუნთში ეს ხშირად აღწერილია, როგორც ბოჭკოების ტიპები, რომლებიც ხასიათდება ძალის წარმოქმნისა და დაღლილობის სხვადასხვა ხარისხით. თუმცა, ცხადია, რომ ეს ხსნის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ცვალებადობის მხოლოდ მცირე ნაწილს, რომელიც გაცილებით ცვალებადი, რთული და მრავალმხრივია, ვიდრე ადრე ეგონათ. ტექნოლოგიურმა მიღწევებმა ახლა ნათელი მოჰფინა ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების მარეგულირებელ ფაქტორებს. მართლაც, ჩვენი მონაცემები მიუთითებს, რომ ტიპი 2X ბოჭკოები შეიძლება არ იყოს ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ცალკეული ქვეტიპი. გარდა ამისა, ჩვენ გამოვავლინეთ მეტაბოლური ცილები, რიბოსომული ცილები და უჯრედთან ასოცირებული ცილები, როგორც ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის ძირითადი განმსაზღვრელი ფაქტორები. ჩვენი პროტეომიკური სამუშაო პროცესის გამოყენებით ნემატოდური მიოპათიის მქონე პაციენტების ნიმუშებზე, ჩვენ ასევე ვაჩვენეთ, რომ MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოების ტიპირება სრულად არ ასახავს ჩონჩხის კუნთების ჰეტეროგენულობას, განსაკუთრებით მაშინ, როდესაც სისტემა შეწუხებულია. მართლაც, MYH-ზე დაფუძნებული ბოჭკოების ტიპის მიუხედავად, ნემატოდური მიოპათია იწვევს გადასვლას უფრო სწრაფი და ნაკლებად ჟანგვითი ბოჭკოებისკენ.
ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების კლასიფიცირება მე-19 საუკუნიდან ხდება. ომიკის ბოლოდროინდელმა ანალიზებმა საშუალება მოგვცა, გაგვეგო სხვადასხვა MYH ბოჭკოების ტიპის ექსპრესიის პროფილები და მათი რეაქციები სხვადასხვა სტიმულებზე. როგორც აქ არის აღწერილი, ომიკის მიდგომებს ასევე აქვთ უპირატესობა, რომ ბოჭკოების ტიპის მარკერების რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის უფრო მეტი მგრძნობელობა აქვთ, ვიდრე ტრადიციულ ანტისხეულებზე დაფუძნებულ მეთოდებს, ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების ტიპის დასადგენად ერთი (ან რამდენიმე) მარკერის რაოდენობრივ განსაზღვრაზე დაყრდნობის გარეშე. ჩვენ გამოვიყენეთ დამატებითი ტრანსკრიპტომიული და პროტეომიკური სამუშაო პროცესები და გავაერთიანეთ შედეგები, რათა შეგვესწავლა ბოჭკოების ჰეტეროგენულობის ტრანსკრიფციული და პოსტტრანსკრიფციული რეგულირება ადამიანის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში. ამ სამუშაო პროცესის შედეგად ვერ მოხერხდა სუფთა 2X ტიპის ბოჭკოების იდენტიფიცირება ცილის დონეზე ჩვენი ჯანმრთელი ახალგაზრდა მამაკაცების ჯგუფის vastus lateralis-ში. ეს შეესაბამება ერთუჯრედიან წინა კვლევებს, რომლებშიც ჯანმრთელ vastus lateralis-ში <1% სუფთა 2X ბოჭკოები აღმოაჩინეს, თუმცა ეს მომავალში სხვა კუნთებშიც უნდა დადასტურდეს. შეუსაბამობა mRNA დონეზე თითქმის სუფთა 2X ბოჭკოების აღმოჩენასა და ცილის დონეზე მხოლოდ შერეული 2A/2X ბოჭკოების აღმოჩენას შორის გაუგებარია. MYH იზოფორმის mRNA ექსპრესია ცირკადული არ არის,67 რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ნაკლებად სავარაუდოა, რომ „გამოგვრჩენოდა“ MYH2-ის დაწყების სიგნალი, ერთი შეხედვით სუფთა 2X ბოჭკოებში რნმ-ის დონეზე. ერთ-ერთი შესაძლო ახსნა, თუმცა წმინდა ჰიპოთეტური, შეიძლება იყოს ცილის და/ან mRNA სტაბილურობის განსხვავებები MYH იზოფორმებს შორის. მართლაც, არცერთი სწრაფი ბოჭკო არ არის 100%-ით სუფთა რომელიმე MYH იზოფორმისთვის და გაურკვეველია, გამოიწვევს თუ არა MYH1 mRNA ექსპრესიის დონე 70–90%-იან დიაპაზონში MYH1-ის და MYH2-ის თანაბარ სიჭარბეს ცილის დონეზე. თუმცა, მთლიანი ტრანსკრიპტომის ან პროტეომის განხილვისას, კლასტერული ანალიზით შესაძლებელია მხოლოდ ორი განსხვავებული კლასტერის იდენტიფიცირება, რომლებიც წარმოადგენენ ნელ და სწრაფ ჩონჩხის კუნთოვან ბოჭკოებს, მათი ზუსტი MYH შემადგენლობის მიუხედავად. ეს თანხვედრაშია ერთბირთვიანი ტრანსკრიპტომიული მიდგომების გამოყენებით ჩატარებულ ანალიზებთან, რომლებიც, როგორც წესი, მხოლოდ ორ განსხვავებულ მიონუკლეარულ კლასტერს იდენტიფიცირებენ. 68, 69, 70 გარდა ამისა, მიუხედავად იმისა, რომ წინა პროტეომიკურმა კვლევებმა გამოავლინა მე-2X ტიპის ბოჭკოები, ეს ბოჭკოები არ ჯგუფდება დანარჩენი სწრაფი ბოჭკოებისგან განცალკევებით და ავლენენ მხოლოდ მცირე რაოდენობის დიფერენცირებულად უხვად ცილებს MYH-ზე დაფუძნებულ სხვა ბოჭკოების ტიპებთან შედარებით.14 ეს შედეგები მიუთითებს, რომ ჩვენ უნდა დავუბრუნდეთ მე-20 საუკუნის დასაწყისის კუნთოვანი ბოჭკოების კლასიფიკაციის შეხედულებას, რომელიც ადამიანის ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებს ყოფდა არა სამ განსხვავებულ კლასად MYH-ზე დაყრდნობით, არამედ ორ კლასტერად მათი მეტაბოლური და შეკუმშვის თვისებების მიხედვით.63
უფრო მნიშვნელოვანია, რომ მიოფიბრის ჰეტეროგენულობა მრავალ განზომილებაში უნდა იქნას განხილული. წინა „ომიკის“ კვლევები ამ მიმართულებით მიუთითებს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოები არ ქმნიან დისკრეტულ კლასტერებს, არამედ განლაგებულია უწყვეტად.11, 13, 14, 64, 71 აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ჩონჩხის კუნთების შეკუმშვისა და მეტაბოლური თვისებების განსხვავებების გარდა, მიოფიბრის დიფერენცირება შესაძლებელია უჯრედშორის ურთიერთქმედებასთან და ტრანსლაციის მექანიზმებთან დაკავშირებული მახასიათებლებით. მართლაც, ჩვენ აღმოვაჩინეთ რიბოსომის ჰეტეროგენულობა ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოებში, რაც ხელს უწყობს ჰეტეროგენულობას ნელი და სწრაფი ბოჭკოების ტიპებისგან დამოუკიდებლად. ამ მნიშვნელოვანი მიოფიბრის ჰეტეროგენულობის გამომწვევი მიზეზი, რომელიც დამოუკიდებელია ნელი და სწრაფი ბოჭკოების ტიპისგან, გაურკვეველი რჩება, მაგრამ ეს შეიძლება მიუთითებდეს კუნთების შეკვრებში სპეციალიზებულ სივრცულ ორგანიზაციაზე, რომლებიც ოპტიმალურად რეაგირებენ სპეციფიკურ ძალებსა და დატვირთვებზე,72 სპეციალიზებულ უჯრედულ ან ორგანოსპეციფიკურ კომუნიკაციაზე კუნთების მიკროგარემოში სხვა უჯრედების ტიპებთან73,74,75 ან რიბოსომის აქტივობის განსხვავებებზე ცალკეულ მიოფიბრებში. მართლაც, რიბოსომული ჰეტეროპლაზმია, როგორც RPL3-ის და RPL3L-ის პარალოგური ჩანაცვლების გზით, ასევე rRNA-ს 2′O-მეთილირების დონეზე, ასოცირდება ჩონჩხის კუნთების ჰიპერტროფიასთან76,77. მულტიომიკური და სივრცითი გამოყენება ინდივიდუალური მიოფიბრების ფუნქციურ დახასიათებასთან ერთად კიდევ უფრო გააღრმავებს კუნთების ბიოლოგიის ჩვენს გაგებას მულტიომიკურ დონეზე78.
ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტების ცალკეული მიოფიბრების პროტეომების ანალიზით, ჩვენ ასევე ვაჩვენეთ ცალკეული მიოფიბრების პროტეომიკის სარგებლიანობა, ეფექტურობა და გამოყენებადობა ჩონჩხის კუნთების კლინიკური პათოფიზიოლოგიის გასარკვევად. გარდა ამისა, ჩვენი სამუშაო პროცესის გლობალურ პროტეომიკურ ანალიზთან შედარებით, ჩვენ შევძელით გვეჩვენებინა, რომ ცალკეული მიოფიბრების პროტეომიკა იძლევა ინფორმაციის იმავე სიღრმეს, რასაც გლობალური ქსოვილების პროტეომიკა და აფართოებს ამ სიღრმეს ბოჭკოებს შორის ჰეტეროგენულობისა და მიოფიბრების ტიპის გათვალისწინებით. ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიებში ჯანმრთელ კონტროლთან შედარებით დაფიქსირებული ბოჭკოების ტიპის თანაფარდობის მოსალოდნელი (თუმცა ცვალებადი) განსხვავებების გარდა,19 ჩვენ ასევე დავაკვირდით ჟანგვით და უჯრედგარე რემოდელირებას, რომელიც დამოუკიდებელია MYH-განპირობებული ბოჭკოების ტიპის გადართვისგან. ფიბროზი ადრეც იყო აღწერილი TNNT1 ნემალინის მიოპათიების დროს.19 თუმცა, ჩვენი ანალიზი ამ აღმოჩენას ეფუძნება და ასევე ავლენს უჯრედგარე სეკრეტირებული სტრესთან დაკავშირებული ცილების, როგორიცაა ანექსინები, მომატებულ დონეს, რომლებიც მონაწილეობენ სარკოლემის აღდგენის მექანიზმებში, ACTA1 და TNNT1 ნემალინის მიოპათიების მქონე პაციენტების მიოფიბრებში.57,58,59 დასკვნის სახით, ნემალინის მიოპათიის მქონე პაციენტების მიოფიბრებში ანექსინის მომატებული დონე შეიძლება წარმოადგენდეს უჯრედულ პასუხს მძიმე ატროფიული მიოფიბრების აღდგენისთვის.
მიუხედავად იმისა, რომ ეს კვლევა წარმოადგენს დღემდე ადამიანებში ჩატარებულ ყველაზე მასშტაბურ ერთბოჭკოიან მთელი კუნთის ომიკურ ანალიზს, ის შეზღუდვების გარეშე არ არის. ჩვენ გამოვყავით ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოები მონაწილეთა შედარებით მცირე და ერთგვაროვანი ნიმუშიდან და ერთი კუნთიდან (vastus lateralis). ამიტომ, შეუძლებელია გამოვრიცხოთ სპეციფიკური ბოჭკოვანი პოპულაციების არსებობა კუნთების ტიპებსა და კუნთების ფიზიოლოგიის უკიდურესობებში. მაგალითად, ჩვენ არ შეგვიძლია გამოვრიცხოთ ულტრასწრაფი ბოჭკოების ქვესიმრავლის (მაგ., სუფთა 2X ბოჭკოების) გაჩენის შესაძლებლობა მაღალკვალიფიციურ სპრინტერებსა და/ან ძალისმიერი სპორტსმენებში79 ან კუნთოვანი უმოქმედობის პერიოდებში66,80. გარდა ამისა, მონაწილეთა შეზღუდული ნიმუშის ზომა ხელს გვიშლიდა ბოჭკოების ჰეტეროგენულობაში სქესობრივი განსხვავებების გამოკვლევაში, რადგან ცნობილია, რომ ბოჭკოების ტიპის თანაფარდობები განსხვავდება მამაკაცებსა და ქალებს შორის. გარდა ამისა, ჩვენ ვერ შევძელით ტრანსკრიპტომიული და პროტეომიკური ანალიზების ჩატარება იმავე კუნთოვან ბოჭკოებზე ან იმავე მონაწილეთა ნიმუშებზე. რადგან ჩვენ და სხვები ვაგრძელებთ ერთუჯრედიანი და ერთმიოფიბრის ანალიზების ოპტიმიზაციას ომიკური ანალიზის გამოყენებით, რათა მივაღწიოთ ულტრადაბალი ნიმუშის შეყვანას (როგორც ეს ნაჩვენებია მიტოქონდრიული მიოპათიის მქონე პაციენტების ბოჭკოების ანალიზში), აშკარა ხდება მრავალუჯრედიანი (და ფუნქციური) მიდგომების გაერთიანების შესაძლებლობა ცალკეული კუნთოვანი ბოჭკოების ფარგლებში.
საერთო ჯამში, ჩვენი მონაცემები განსაზღვრავს და ხსნის ჩონჩხის კუნთების ჰეტეროგენულობის ტრანსკრიფციულ და პოსტტრანსკრიფციულ მამოძრავებელ ფაქტორებს. კერძოდ, ჩვენ წარმოგიდგენთ მონაცემებს, რომლებიც ეჭვქვეშ აყენებს ჩონჩხის კუნთების ფიზიოლოგიაში არსებულ დიდი ხნის დოგმას, რომელიც დაკავშირებულია ბოჭკოების ტიპების კლასიკურ MYH-ზე დაფუძნებულ განმარტებასთან. ვიმედოვნებთ, რომ განაახლებთ დებატებს და საბოლოოდ გადავხედავთ ჩვენს გაგებას ჩონჩხის კუნთების ბოჭკოების კლასიფიკაციისა და ჰეტეროგენულობის შესახებ.
კვლევაში მონაწილეობაზე თანხმობა განაცხადა თოთხმეტი კავკასიელი მონაწილე (12 მამაკაცი და 2 ქალი). კვლევა დამტკიცდა გენტის უნივერსიტეტის საავადმყოფოს (BC-10237) ეთიკის კომიტეტის მიერ, შეესაბამებოდა 2013 წლის ჰელსინკის დეკლარაციას და დარეგისტრირდა ClinicalTrials.gov-ზე (NCT05131555). მონაწილეთა ზოგადი მახასიათებლები წარმოდგენილია დამატებით ცხრილში 1. ვერბალური და წერილობითი ინფორმირებული თანხმობის მიღების შემდეგ, კვლევაში საბოლოო ჩართვამდე მონაწილეებს ჩაუტარდათ სამედიცინო შემოწმება. მონაწილეები იყვნენ ახალგაზრდები (22–42 წლის), ჯანმრთელები (არ ჰქონდათ სამედიცინო პრობლემები, არ ჰქონდათ მოწევის ისტორია) და ზომიერად ფიზიკურად აქტიურები. ჟანგბადის მაქსიმალური მოხმარება განისაზღვრა ფიზიკური მომზადების შესაფასებლად საფეხურებრივი ერგომეტრის გამოყენებით, როგორც ეს ადრე იყო აღწერილი. 81
კუნთის ბიოფსიის ნიმუშები აღებული იქნა სამჯერ, 14-დღიანი ინტერვალით მოსვენებულ და უზმოზე. რადგან ეს ნიმუშები შეგროვდა უფრო ფართო კვლევის ფარგლებში, მონაწილეებმა ბიოფსიამდე 40 წუთით ადრე მოიხმარეს პლაცებო (ლაქტოზა), H1-რეცეპტორების ანტაგონისტი (540 მგ ფექსოფენადინი) ან H2-რეცეპტორების ანტაგონისტი (40 მგ ფამოტიდინი). ჩვენ ადრე ვაჩვენეთ, რომ ჰისტამინის რეცეპტორების ეს ანტაგონისტები არ მოქმედებენ მოსვენებულ ჩონჩხის კუნთების ფიზიკურ მდგომარეობაზე81 და ჩვენს ხარისხის კონტროლის დიაგრამებში (დამატებითი სურათებში 3 და 6) მდგომარეობასთან დაკავშირებული კლასტერიზაცია არ დაფიქსირებულა. სტანდარტიზებული დიეტა (41.4 კკალ/კგ სხეულის წონა, 5.1 გ/კგ სხეულის წონა ნახშირწყლები, 1.4 გ/კგ სხეულის წონა ცილა და 1.6 გ/კგ სხეულის წონა ცხიმი) შენარჩუნებული იყო ექსპერიმენტის თითოეული დღის წინ 48 საათის განმავლობაში და სტანდარტიზებული საუზმე (1.5 გ/კგ სხეულის წონა ნახშირწყლები) მიიღებოდა ექსპერიმენტის დღის დილით. ადგილობრივი ანესთეზიის ქვეშ (0.5 მლ 1%-იანი ლიდოკაინი ეპინეფრინის გარეშე), კუნთის ბიოფსიები აღებული იქნა გვერდითი ძვლის კუნთიდან პერკუტანული ბერგსტრომის ასპირაციის გამოყენებით.82 კუნთების ნიმუშები დაუყოვნებლივ იქნა ჩადგმული RNAlater-ში და შენახული იქნა 4°C ტემპერატურაზე ბოჭკოების ხელით დისექციამდე (3 დღემდე).
ახლად იზოლირებული მიოფიბერის კონები გადატანილი იქნა ახალ RNA ლატერალურ გარემოში კულტურულ ჭურჭელში. ინდივიდუალური მიოფიბერები შემდეგ ხელით დაშალეს სტერეომიკროსკოპისა და წვრილი პინცეტით. თითოეული ბიოფსიიდან 25 ბოჭკო დაშალეს, განსაკუთრებული ყურადღება დაეთმო ბიოფსიის სხვადასხვა უბნიდან ბოჭკოების შერჩევას. დაშალების შემდეგ, თითოეული ბოჭკო ფრთხილად ჩაეფლო 3 μl ლიზისის ბუფერში (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), რომელიც შეიცავდა პროტეინაზა K და DNase ფერმენტებს არასასურველი ცილებისა და დნმ-ის მოსაშორებლად. უჯრედის ლიზისი და ცილის/დნმ-ის მოცილება დაიწყო ხანმოკლე მორევით, სითხის მიკროცენტრიფუგაში დატრიალებით და ოთახის ტემპერატურაზე ინკუბაციით (10 წთ). შემდეგ ლიზატი ინკუბირებული იქნა თერმულ ციკლერში (T100, Bio-Rad) 37°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში, 75°C-ზე 5 წუთის განმავლობაში და შემდეგ დაუყოვნებლივ შეინახეს -80°C-ზე შემდგომ დამუშავებამდე.
Illumina-თან თავსებადი პოლიადენილირებული რნმ-ის ბიბლიოთეკები მომზადდა მიოფიბერის ლიზატის 2 µლ-დან QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq ბიბლიოთეკის მოსამზადებელი ნაკრების (Lexogen) გამოყენებით. დეტალური მეთოდების ნახვა შეგიძლიათ მწარმოებლის სახელმძღვანელოში. პროცესი იწყება პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზით უკუტრანსკრიფციით, რომლის დროსაც შეჰყავთ უნიკალური მოლეკულური იდენტიფიკატორები (UMI) და ნიმუშისთვის სპეციფიკური i1 შტრიხკოდები, რათა უზრუნველყოფილი იყოს ნიმუშების გაერთიანება და შემცირდეს ტექნიკური ცვალებადობა შემდგომი დამუშავების დროს. შემდეგ 96 მიოფიბერის cDNA გაერთიანებულია და იწმინდება მაგნიტური მძივებით, რის შემდეგაც რნმ ამოღებულია და მეორე ჯაჭვის სინთეზი ხორციელდება შემთხვევითი პრაიმერების გამოყენებით. ბიბლიოთეკა იწმინდება მაგნიტური მძივებით, ემატება პულ-სპეციფიკური i5/i7 ტეგები და ამპლიფიცირდება PCR. საბოლოო გაწმენდის ეტაპი წარმოქმნის Illumina-სთან თავსებად ბიბლიოთეკებს. თითოეული ბიბლიოთეკის პულის ხარისხი შეფასდა მაღალი მგრძნობელობის მცირე ფრაგმენტის დნმ ანალიზის ნაკრების (Agilent Technologies, DNF-477-0500) გამოყენებით.
ქუბიტის რაოდენობრივი განსაზღვრის საფუძველზე, ჯგუფები შემდგომში გაერთიანდა ეკვიმოლური კონცენტრაციებით (2 ნმ). შედეგად მიღებული ჯგუფი შემდეგ სეკვენირებული იქნა NovaSeq 6000 ინსტრუმენტზე სტანდარტულ რეჟიმში, NovaSeq S2 რეაგენტის ნაკრების (1 × 100 ნუკლეოტიდი) გამოყენებით 2 ნმ დატვირთვით (4% PhiX).
ჩვენი მონაცემთა ანალიზის პროცესი Lexogen-ის QuantSeq Pool მონაცემთა ანალიზის პროცესორზეა დაფუძნებული (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). მონაცემები თავდაპირველად დემულტიპლექსირებული იქნა bcl2fastq2-ით (v2.20.0) i7/i5 ინდექსის საფუძველზე. შემდეგ წაკითხული 2-ის დემულტიპლექსირებული იქნა idemux-ით (v0.1.6) i1 ნიმუშის შტრიხკოდის საფუძველზე და UMI თანმიმდევრობები ამოღებული იქნა umi_tools-ით (v1.0.1). წაკითხული მონაცემები შემდეგ რამდენიმე რაუნდად იქნა ამოჭრილი cutadapt-ით (v3.4) მოკლე წაკითხული მონაცემების (<20 სიგრძის) ან ადაპტერის თანმიმდევრობისგან შემდგარი წაკითხული მონაცემების მოსაშორებლად. წაკითხული მონაცემები შემდეგ ადამიანის გენომთან გასწორდა STAR-ის (v2.6.0c) გამოყენებით და BAM ფაილები ინდექსირებული იქნა SAMtools-ით (v1.11). დუბლიკატი წაკითხული მონაცემები წაიშალა umi_tools-ის (v1.0.1) გამოყენებით. დაბოლოს, გასწორების დათვლა ჩატარდა Subread-ში (v2.0.3) featureCounts-ის გამოყენებით. ხარისხის კონტროლი განხორციელდა FastQC-ის (v0.11.9) გამოყენებით მილსადენის რამდენიმე შუალედურ ეტაპზე.
ბიოინფორმატიკული დამუშავებისა და ვიზუალიზაციის შემდგომი ყველა პროცესი ჩატარდა R (v4.2.3) ფორმატში, ძირითადად Seurat (v4.4.0) სამუშაო პროცესის გამოყენებით.83 ამიტომ, ინდივიდუალური UMI მნიშვნელობები და მეტამონაცემების მატრიცები გარდაიქმნა Seurat ობიექტებად. ყველა ბოჭკოს 30%-ზე ნაკლებში გამოხატული გენები ამოიღეს. დაბალი ხარისხის ნიმუშები ამოიღეს 1000 UMI მნიშვნელობისა და 1000 აღმოჩენილი გენის მინიმალური ზღურბლის საფუძველზე. საბოლოო ჯამში, 925 ბოჭკომ გაიარა ხარისხის კონტროლის ფილტრაციის ყველა ეტაპი. UMI მნიშვნელობები ნორმალიზებული იქნა Seurat SCTransform v2 მეთოდის გამოყენებით,84 ყველა 7418 აღმოჩენილი მახასიათებლის ჩათვლით, ხოლო მონაწილეებს შორის განსხვავებები რეგრესირებული იქნა. ყველა შესაბამისი მეტამონაცემების პოვნა შესაძლებელია დამატებით მონაცემთა ნაკრებში 28.